Haberler

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, desteğin devam etmesini sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Kanser hücreleri, hücresel stresin üstesinden gelmek ve ilerlemeye devam etmek için çeşitli mekanizmalar geliştirmiştir.Protein kinaz R (PKR) ve protein aktivatörü (PACT), hücre proliferasyonu ve apoptozun inhibisyonuna yol açan çeşitli stres sinyallerini izleyen ilk yanıt verenlerdir.Bununla birlikte, kanser hücrelerinde PACT-PKR yolunun düzenlenmesi büyük ölçüde bilinmemektedir.Burada, uzun kodlamayan RNA (lncRNA) aspartil tRNA sentetaz antisens RNA 1'in (DARS-AS1), PACT-PKR yolunun inhibisyonunda doğrudan yer aldığını ve kanser hücresi çoğalmasını desteklediğini bulduk.CRISPRi 971 kanserle ilişkili lncRNA'nın geniş ölçekli fonksiyonel taramasını kullanarak, DARS-AS1'in önemli ölçüde gelişmiş kanser hücresi proliferasyonu ile ilişkili olduğunu bulduk.Bu nedenle, DARS-AS1 nakavt hücre proliferasyonunu inhibe eder ve çeşitli kanser hücre dizilerinde kanser hücresi apoptozunu in vitro teşvik eder ve in vivo olarak tümör büyümesini önemli ölçüde azaltır.Mekanik olarak, DARS-AS1, doğrudan PACT aktivasyon alanına bağlanır ve PACT-PKR etkileşimini önler, böylece PKR aktivasyonunu, eIF2a fosforilasyonunu azaltır ve apoptotik hücre ölümünü inhibe eder.Klinik olarak, DARS-AS1, çoklu kanserlerde yaygın olarak eksprese edilir ve bu lncRNA'nın aşırı ekspresyonu, kötü bir prognozun göstergesidir.Bu çalışma, PACT-PKR yolunun DARS-AS1 lncRNA tarafından kansere özgü düzenlenmesini açıklar ve kanser prognozu ve tedavisi için başka bir hedef sağlar.
Strese uyum sağlama yeteneği, kanser hücresinin hayatta kalması ve çoğalmasının önemli bir özelliğidir.Kanserin hızlı proliferasyonu ve metabolik özellikleri, hücre ölümü sinyal yollarını tetikleyebilen, besin yoksunluğu, hipoksi ve düşük pH gibi zorlu mikro ortamlarda zirveye ulaşır.p535, ısı şoku proteinleri 6, 7, KRAS8, 9 ve HIF-110, 11, 12, 13 gibi strese duyarlı genlerin düzensizliği kanserde sıklıkla gözlenir, böylece apoptozu bloke eder ve hayatta kalmayı destekler.
Protein kinaz R (PKR), önemli bir stres sensörü ve ökaryotik başlatma faktörü 2a'nın (eIF2a) alt birim kinazı, hücresel stresi hücre ölümüne bağlayan bir translasyonel düzenleyicidir.PKR, başlangıçta bir yabancı çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) saptanmasıyla bir antiviral protein olarak tanımlandı.Aktivasyon üzerine, PKR, viral ve hücresel protein sentezini14,15,16 inhibe etmek için eIF2a'yı fosforile eder.PACT (PKR aktivatör proteini), dsRNA17,18,19,20,21,22,23'ün yokluğunda ilk PKR aktivatör proteini olarak tanımlanmıştır.PKR ile doğrudan etkileşim yoluyla, PACT, çeşitli stresleri (serum açlığı, peroksit veya arsenit tedavisi) PKR'ye ve aşağı akış sinyal yollarına iletir.eIF2a fosforilasyonuna ek olarak, PACT aracılı PKR aktivasyonu, PI3K/Akt24 yolu aracılığıyla değiştirilmiş redoks durumu, p5325,26 ve NF-κB27,28 aracılığıyla geliştirilmiş DNA hasar kontrolü dahil olmak üzere stres tepkisi ile ilişkili çeşitli olayları tetikler. Stres tepkisi, çoğalma, apoptoz ve diğer önemli hücresel süreçlerdeki kritik rolleri göz önüne alındığında, PKR ve PACT birçok hastalık, özellikle kanser30,31,32,33 için umut verici terapötik hedeflerdir.Bununla birlikte, bu pleiotropik fonksiyonel ve biyolojik öneme rağmen, kanser hücrelerinde PACT/PKR aktivitesinin düzenlenmesi belirsizliğini koruyor.
lncRNA'lar, protein kodlama potansiyeli olmayan 200 nükleotitten daha büyük transkriptlerdir.Son teknoloji tüm genom dizileme projeleri binlerce lncRNA tanımladığından,35,36 biyolojik işlevlerini açıklamak için çok çaba sarf edilmiştir.Büyüyen bir araştırma grubu, lncRNA'ların, X kromozomu inaktivasyonunun düzenlenmesi38,39, baskılama40, transkripsiyon41,42, çeviri43 ve hatta kanser büyümesi44,45,46,47 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte 37 yer aldığını göstermiştir.Bu çalışmalar, birçok lncRNA'nın PACT/PKR yolunda yer aldığını bildirdi.Böyle bir çalışma, lncRNA ASPACT'ın PACT transkripsiyonunu inhibe ettiğini ve PACT mRNA'nın nükleer retansiyonunu arttırdığını gösterdi.Diğer çalışmalar, lncRNA nc886'nın PKR'ye bağlandığını ve fosforilasyonunu engellediğini göstermiştir49,50.Şimdiye kadar, PACT aracılı PKR aktivasyonunu düzenleyen lncRNA bildirilmemiştir.
Aspartil-tRNA sentetaz antisens RNA 1 (DARS-AS1) onkojenik bir lncRNA51,52,53,54 olarak tanımlanmıştır.miP-194-5p53, miP-12952 ve miP-532-3p51'in düzenlenmesi yoluyla, DARS-AS1'in sırasıyla berrak hücreli renal hücreli karsinom, tiroid karsinomu ve küçük hücreli olmayan akciğer karsinomunun büyümesini desteklediği gösterilmiştir.Tong ve meslektaşları ayrıca DARS-AS1'in protein 39 (RBM39) RNA bağlama motifinin stabilitesini koruyarak miyelom ilerlemesini desteklediğini buldu.Bununla birlikte, bu lncRNA'nın PACT-PKR aktivasyonunun düzenlenmesinde ve kanser hücrelerinin stres tepkisinde yer alıp almadığı konusunda herhangi bir çalışma yapılmamıştır.
Burada, CRISPRi sistemini kullanarak büyük ölçekli bir işlev kaybı taraması gerçekleştirdik ve DARS-AS1 lncRNA'nın çeşitli kanser hücrelerinin çoğalmasını desteklediğini belirledik.Ek olarak, önemli bir mekanizma belirledik: DARS-AS1 doğrudan PACT'ye bağlanır, PACT ve PKR bağlanmasını engeller, daha düşük bir PKR substratı olan eIF2a'nın fosforilasyonunu önler ve nihayetinde apoptotik hücre ölümünü engeller.Sonuç olarak, çalışmamız DARS-AS1 lncRNA'yı PACT-PKR yolunun düzenleyicisi ve kanser tedavisi ve prognozu için potansiyel bir hedef olarak ortaya koymaktadır.
Kapsamlı genomik profilleme çalışmaları, kanserle ilişkili yüzlerce lncRNA tanımlamıştır.Bununla birlikte, işlevleri büyük ölçüde bilinmemektedir56.Kanser ilerlemesinde rol oynayan umut verici lncRNA adaylarını belirlemek için, CRISPRi sistemini kullanarak SW620 kolorektal kanser hücre hattında proliferasyonun azalması için bir fonksiyon kaybı taraması gerçekleştirdik (Şekil 1a).SW480 ve SW620 kolon kanseri hücre dizilerinin benzersiz özelliği, tek bir hastadaki birincil ve ikincil tümörlerden türetilmeleridir.Bu, ilerlemiş kolon kanserinin ilerlemesindeki genetik değişiklikleri incelemek için değerli bir karşılaştırma sağlar.Bu nedenle, RNA dizilimi kullanarak kolorektal kanser hücre hatlarının (SW480 ve SW620) transkriptomlarını analiz ettik ve yayınlanmış literatürden bazı potansiyel fonksiyonel lncRNA'ları topladık.Bu sonuçlara dayanarak, 971 kanserle ilişkili lncRNA'yı hedefleyen 7355 sgRNA oligo ve negatif bir kontrol için 500 hedeflenmemiş sgRNA oligo içeren havuzlanmış bir sgRNA kitaplığı tasarladık (Ek Veri 1).
CRISPRi sistemi kullanılarak taramanın şematik gösterimi.b taramadan sonra sgRNA zenginleştirmesi.Yatay noktalı çizgi, log2 (kat değişimi) = ±0.58'i temsil eder.Dikey noktalı çizgi p değeri = 0.05'i gösterir.Siyah noktalar, hedef olmayan sgRNA'yı temsil eder (NC olarak belirtilir).Kırmızı noktalar, DARS-AS1'i hedefleyen sgRNA'lardır.Mavi noktalar, daha önce açıklanan bir onkojenik lncRNA olan LINC00205'i hedefleyen sgRNA'lardır.kat değişimi = (normalleştirilmiş okuma, 17. gün)/(normalleştirilmiş okuma, 0. gün).c DARS-AS1 sgRNA yıkımı hücre büyümesini inhibe etti.Hata çubukları, üç deneyin ± standart sapmasını temsil eder.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 iki kuyruklu Student t testi.d Tümörlerde DARS-AS1 ifadesi (TCGA veri seti).em DARS-AS1'in sırasıyla BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ve COAD'li hastalardan alınan eşleştirilmiş normal ve tümör numunelerinde ifadesi (TCGA veri seti).p değerleri, eşleştirilmiş iki kuyruklu Student t testi kullanılarak elde edildi.
Plazmidi oluşturup lentivirüsü paketledikten sonra, dört bağımsız enfeksiyon deneyinde dCas9-SW620 kolorektal kanser hücre hattını yukarıdaki kitaplıkla dönüştürdük.Bu enfeksiyonlar için enfeksiyon çokluğu (MOI) 0.1-0.3 idi, bu da her hücrenin yalnızca bir sgRNA ile transfekte edilebileceğini gösterir.18 günlük in vitro kültürden sonra, hedef sgRNA'ların zenginleştirme profili, taramadan sonra azaldı veya artarken, hedeflenmemiş kontrol oligonükleotitlerinin sayısı, ön tarama profiline kıyasla nispeten değişmeden kaldı, bu da hedefimizin yüksek oranda taramaya özel olduğunu gösteriyor. kütüphane.Pirinç.1b ve ek tablo 1). Daha önce akciğer kanserini ve karaciğer kanseri ilerlemesini arttırdığı bildirilen LINC0020558,59,60 tarandı (log2 (kat değişimi) < -0,58, p değeri < 0.05), bu taramanın güvenilirliği doğrulandı (Şekil 1b). Daha önce akciğer kanserini ve karaciğer kanseri ilerlemesini arttırdığı bildirilen LINC0020558,59,60 tarandı (log2 (kat değişimi) < -0,58, p değeri < 0.05), bu taramanın güvenilirliği doğrulandı (Şekil 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). Daha önce akciğer kanseri ve karaciğer kanserinin ilerlemesini desteklediği rapor edilen LINC0020558,59,60 hariç tutulmuştur (log2 (kat değişimi) <-0.58, p-değeri <0.05), bu taramanın sağlamlığını doğrular (Şekil .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). Daha önce akciğer ve karaciğer kanseri ilerlemesini desteklediği rapor edilen LINC0020558,59,60 hariç tutulmuştur (log2 (kat değişimi) <-0.58, p-değeri <0.05), bu taramanın sağlamlığını doğrular (Şekil .1b).
Test edilen tüm lncRNA'lar arasında DARS-AS1 de tarandı, üç aynı kökenli sgRNA oligonükleotidi 18 günlük kültürden sonra önemli ölçüde azaldı, bu lncRNA'nın yıkılmasının kanser proliferasyonunun azalmasıyla sonuçlandığını düşündürdü (Şekil 1b).Bu sonuç, kolorektal kanser hücrelerinde MTS analizi ile daha da desteklendi ve DARS-AS1 devrilme hücrelerinin büyüme oranının kontrol hücrelerine kıyasla sadece yarıya indirildiğini (Şekil 1c) ve diğer birkaç kanser türünün önceki raporlarıyla tutarlı olduğunu gösterdi.: berrak hücreli böbrek kanseri, tiroid kanseri ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri51,52,53,55.Bununla birlikte, kolorektal kanserdeki işlevi ve moleküler mekanizmaları henüz keşfedilmemiştir.Bu nedenle, daha fazla çalışma için bu lncRNA'yı seçtik.
Hastalarda DARS-AS1 ekspresyonunu incelemek için Cancer Genome Atlas (TCGA) projesinden 10.327 tümör örneğini kapsamlı bir şekilde analiz ettik.Sonuçlarımız, DARS-AS1'in kolon adenokarsinomu (COAD), renal berrak hücreli karsinom (KIRC) ve renal papiller hücreli karsinom (KIRP) dahil olmak üzere çeşitli tümörlerdeki sağlıklı hücrelerde yaygın olarak eksprese edildiğini ve önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini göstermektedir..Çok az (Şekil 1d ve Ek Şekil 1a, b). Eşleştirilmiş sağlıklı/tümör numunelerinin analizi ayrıca mesane ürotelyal karsinomu (BLCA), böbrek renal berrak hücreli karsinom (KIRC), prostat adenokarsinomu (PRAD), akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC) tümörlerinde DARS-AS1'in önemli ölçüde daha yüksek ekspresyonunu doğruladı. , uterin korpus endometriyal karsinom (UCEC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), karaciğer hepatoselüler karsinomu (LIHC), böbrek renal papiller hücreli karsinom (KIRP) ve kolon adenokarsinomu (COAD) (p değeri < 0.05) (Şekil 1e–m) . Eşleştirilmiş sağlıklı/tümör numunelerinin analizi ayrıca mesane ürotelyal karsinomu (BLCA), böbrek renal berrak hücreli karsinom (KIRC), prostat adenokarsinomu (PRAD), akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC) tümörlerinde DARS-AS1'in önemli ölçüde daha yüksek ekspresyonunu doğruladı. , uterin korpus endometriyal karsinom (UCEC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), karaciğer hepatoselüler karsinomu (LIHC), böbrek renal papiller hücreli karsinom (KIRP) ve kolon adenokarsinomu (COAD) (p değeri < 0.05) (Şekil 1e–m) .Eşleştirilmiş sağlıklı/tümör numunelerinin analizi ayrıca mesane ürotelyal karsinom (BLCA), berrak hücreli renal ve renal hücreli karsinom (KIRC), prostat adenokarsinomu (PRAD), akciğer skuamöz hücreli karsinom (LUSC) tümörlerinde önemli ölçüde daha yüksek DARS-AS1 ekspresyonunu doğruladı., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , korpus uteri endometriyal karsinomu (UCEC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), karaciğer hepatoselüler karsinomu (LIHC), böbreğin papiller hücreli karsinomu (KIRP) ve kolon adenokarsinomu (COAD) (p değeri < 0.05) (Şek. 1e– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0.05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 ， 中 中 更 高 ， ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Sağlıklı/tümör eşleştirilmiş numunelerin analizi, DARS-AS1'in mesane ürotelyal karsinom (BLCA), berrak hücreli renal hücreli karsinom (KIRC), prostat adenokarsinom (PRAD) ve akciğer skuamöz hücreli karsinom (LUSC) tümörlerindeki rolünü daha da destekledi.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). korpus uterin karsinomda (UCEC), akciğer adenokarsinomunda (LUAD), hepatoselüler karsinomda (LIHC), renal papiller hücreli karsinomda (KIRP) ve kolon adenokarsinomunda (COAD) ekspresyon (p değeri <0.05) (Şekil 1e-m).Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar DARS-AS1'in çeşitli kanserlerde yaygın ve yüksek oranda eksprese edildiğini göstermektedir.
DARS-AS1 ve DARS (antisens zincirini kodlayan gen) aynı promotörü paylaştığı ve yan yana bulunduğu için, shRNA'yı DARS-AS1'i spesifik olarak yıkmak için tasarladık, ancak DARS'ı değil (Ek Şekil 2a,b ve Ek Tablo 2) .SW620'ye ek olarak, shRNA yıkımının etkinliğini ve işlevini incelemek için DARS-AS1'i yüksek oranda eksprese eden üç hücre çizgisi daha kullandık (Ek Tablo 3).Sonuçlarımız, geliştirilen üç shRNA'nın hepsinin, DARS mRNA miktarı üzerinde çok az etki ile en az %80 DARS-AS1 devrilme verimliliğine ulaştığını gösterdi (Ek Şekil 2c–f).Ek olarak, bu shRNA'larla DARS-AS1 yıkımının kolorektal kanser hücre dizileri SW620 (%49.7) ve HCT116 (%27.7), meme kanseri hücre dizisi MBA-MD-231'de (%53.4) hücre büyümesini önemli ölçüde inhibe ettiğini bulduk.) ve HepG2 hepatoma hücre çizgisi (%92,7 azalma) ve bunların sabitlenmemiş küreler oluşturma yetenekleri (hücre çizgisi başına ~%50.8, %44.6, %40.7 ve %75.7 ortalama azalma) (Şekil 2a,b).SW620'de koloni oluşturma tahlilinin sonuçları ayrıca DARS-AS1 shRNA'nın ortalama yaklaşık %69.6'lık bir düşüşle hücre proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe ettiğini doğruladı (Şekil 2c).
Kontrol shRNA ve DARS-AS1 shRNA'nın SW620, HCT116, MBA-MD-231 ve HepG2 hücrelerinde hücre proliferasyonu (a) ve sferoid oluşumu (b) üzerindeki etkisi.c Kontrol shRNA ve DARS-AS1 shRNA'nın SW620 hücrelerinde koloni oluşumu üzerindeki etkisi.DARS-AS1'i aşırı eksprese eden SW620 hücrelerinin hücre proliferasyonu (d), sferoid oluşumu (e) ve koloni oluşumu (f).Gösterilen veriler, üç deneyin ortalama ± standart sapmasıdır.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ve *** p ≤ 0.001 iki kuyruklu Student t-testi ile.
İşlev kaybı çalışmalarını tamamlamak için daha sonra DARS-AS1'i aşırı eksprese eden SW620 hücreleri oluşturduk (Ek Şekil 2g).DARS-AS1 aşırı ekspresyonu, SW620 hücrelerinde hücre büyümesini (1.8 kat), bağlanmamış sferoid oluşumunu (1.4 kat) ve koloni oluşumunu (3,3 kat) önemli ölçüde arttırdı (Şekil 2d–f).Bu sonucu, başka bir DARS-AS1 eksprese eden hücre hattı olan A549'u kullanarak doğruladık.DARS-AS1 aşırı ekspresyonuna bağlı bu gelişmiş hücre proliferasyonu, A549 hücrelerinde daha da gözlendi (Ek Şekil 2h, i ve Ek Tablo 3).Birlikte ele alındığında, bu kazanç ve kayıp çalışmaları, DARS-AS1'in in vitro kanser hücresi çoğalmasını desteklediğini göstermektedir.
DARS-AS1'in hücre çoğalmasını düzenlediği altta yatan mekanizmayı keşfetmek için, potansiyel protein bağlama ortaklarını belirlemek için bir RNA aşağı çekme analizi gerçekleştirdik.RT-qPCR sonuçları, DARS-AS1'in yaklaşık% 86.2'sinin SW620 hücrelerinin sitoplazmasında bulunduğunu gösterdi (Ek Şekil 3a).İn vitro kopyalanmış biyotinlenmiş DARS-AS1 veya psödoRNA daha sonra SW620 hücre lizatları ile inkübe edildi, ardından SDS-PAGE ayrımı yapıldı.Müteakip gümüş boyama, DARS-AS1 çekme numunelerinde belirgin bir bandın (~38 kDa) önemli ölçüde zenginleştirildiğini, ancak sahte RNA veya boncuk numunelerinde olmadığını gösterdi (Şekil 3a).Bu bant, kütle spektrometrisi (MS) ile bir PKR aktive edici protein (PACT) olarak tanımlandı ve ayrıca SW620, HCT116 ve HepG2 hücre hatlarında immünoblotlama ile doğrulandı (Şekil 3a,b).DARS ve ilgili PACT proteinlerinin (PKR ve TRBP) zenginleştirilmesi de Western blot (WB) ile RNA analizi kullanılarak araştırıldı.Sonuçlar, DARS-AS1 RNA ile bu üç protein arasında doğrudan bir etkileşim bulunmadığını gösterdi (Ek Şekil 3b).DARS-AS1 ve PACT arasındaki spesifik etkileşim, DARS-AS1'in anti-PACT antikorlarında önemli ölçüde zenginleştirildiğini, ancak diğer kontrol RNA'larında olmadığını gösteren RNA immünopresipitasyon (RIP) analizi ile daha da doğrulandı (Şekil 3c).DARS-AS1'in başka hücresel bileşenlerin yokluğunda doğrudan PACT ile etkileşime girip girmediğini belirlemek için, saflaştırılmış PACT kullanılarak bir in vitro biyo-tabaka interferometrisi (BLI) testi yapıldı.Biyotin etiketli DARS-AS1 veya sahte RNA, streptavidin (SA) biyosensörleri üzerinde hareketsizleştirildi ve ardından 1 uM PACT içeren kinetik tamponda inkübe edildi.Özellikle, PACT, DARS-AS1'e (KD değeri ~26.9 nM) güçlü bir şekilde bağlanır, ancak RNA'yı taklit etmez (Şekil 3d).Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar DARS-AS1 ve PACT arasında doğrudan bir etkileşim ve yüksek afinite gösterir.
RNA çekme analizi, SW620 hücrelerinde PACT ile etkileşime giren DARS-AS1'i tanımladı.Yukarıda, ilgili proteinlerin gümüş boyaması.Anti-PACT antikoru ile daha düşük immünoblotlar yapıldı.b RNA aşağı çekme analizi, HCT116 (üst) ve HepG2 (alt) hücrelerinde gerçekleştirilmiştir.PACT zenginleştirmesi immünoblotlama ile tespit edildi.cRNA immünopresipitasyon (RIP) deneyleri, belirtilen antikorlar kullanılarak SW620 hücrelerinde yapıldı.d Tam uzunluktaki DARS-AS1'e veya kontrol RNA'sına PACT bağlanma eğrileri, biyo-tabaka interferometrisi (BLI) kullanılarak elde edildi.RNA, bir streptavidin biyosensörü üzerinde hareketsizleştirildi.İlişkiyi ölçmek için 1 μM PACT kullanıldı.e RNA çekme deneyi, biyotinlenmiş tam uzunluklu DARS-AS1 veya kesilmiş (üstte) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Alınan PACT'ı gösteren immünoblot (altta).f Saflaştırılmış işaretli PACT, biyotinlenmiş tam uzunlukta DARS-AS1 ile inkübe edildi veya in vitro RIP testi için kesildi (e'deki gibi).Çıkarılan RNA, RT-qPCR ile doğrulandı.g Farklı RNA fragmanlarının PACT için nispi afinitesi, biyo-tabaka interferometrisi kullanılarak elde edildi.Analiz için 100 nM RNA ve 1 uM RAST kullanıldı.h In vitro RIP testleri, saflaştırılmış bozulmamış veya kesilmiş etiketli PACT kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Çıkarılan RNA, RT-qPCR ile doğrulandı.i DARS-AS1, PACT veya her ikisini aşırı ifade eden SW620 hücrelerinin büyüme hızı.j SW620 hücrelerinde tam uzunlukta veya kesik DARS-AS1'in aşırı ekspresyonu, hücre büyümesi üzerinde farklı etkilere sahipti.k Apoptoz, anti-PARP antikoru ile immünoblotlama ile tespit edildi.l DARS-AS1'in devre dışı bırakılması, akış sitometrisi ile gösterildiği gibi SW620 hücrelerinin apoptozunu indükler.Gösterilen veriler, üç deneyin ortalama ± standart sapmasıdır. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t testi ile. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t testi ile. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 iki kuyruklu Student t testi ile. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 iki kuyruklu Student t testi ile.
Daha sonra PACT birliği için gerekli DARS-AS1 bölgesini tanımlamak için in vitro transkripsiyonla üç biyotinlenmiş DARS-AS1 RNA fragmanı oluşturduk (Şekil 3e).RNA analizi sonuçları, her parçanın PACT ile etkileşime girebildiğini gösterdi, ancak 3′-terminal bölgesi (A3 ile etiketlenmiş 384-768 nükleotit), A1 ile etiketlenmiş 1-384'ten fazla nükleotit gösterdi (Şekil 3e).Benzer sonuçlar, rekombinant PACT kullanılarak in vitro RIP tahlilinde gözlendi (Şekil 3f).Bu sonuçlarla tutarlı olarak, BLI kullanılarak hareketsizleştirilmiş RNA fragmanlarını PACT'a bağlama deneyleri, PACT'ın A3 (384-768 nt) için daha yüksek bir afiniteye sahip olduğunu (yaklaşık 94.6 nM KD değeri), diğer alanlarla neredeyse hiç bağlantı olmadığını gösterdi.(Şek. 3d).
Ayrıca PACT'deki ilişkili bağlanma bölgelerini de inceledik.PACT, ikisi korunmuş çift sarmallı RNA bağlama alanları (dsRBD) ve protein etkileşimlerinin bir aktivatörü olarak görev yapan üçüncü bir alan (D3 olarak adlandırılır) olan üç fonksiyonel alan içerir.Her alanın lncRNA bağlama kapasitesini incelemek için, üç alanın her birini kaldıran üç mutasyon tasarladık ve bir in vitro RIP tahlili gerçekleştirdik.Sonuçlarımız, PACT'ın üçüncü alanının (D3) silinmesinin, diğer iki mutasyona (Şekil 3h) kıyasla DARS-AS1 ile etkileşimini önemli ölçüde azalttığını (sağlam PACT ile karşılaştırıldığında 0.11 kat) gösterdi. D3, DARS ile etkileşime girdi.-AC1.Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, DARS-AS1 ve PACT arasındaki etkileşimin, öncelikle DARS-AS1'in 3' ucu ve PACT'ın D3 alanı aracılığıyla gerçekleşebileceğini göstermektedir.
DARS-AS1'in PACT ifadesi üzerinde hiçbir etkisi olmadığını ve PACT'ın DARS-AS1 üzerinde hiçbir etkisi olmadığını kaydettik (Ek Şekil 3c).Daha sonra PACT yıkımının hücre büyümesi üzerindeki etkisini inceledik.DARS-AS1'in aksine, PACT düşürüldüğünde göreceli hücreler 1,5-3 kat daha hızlı büyüdü (Ek Şekil 3d).Koloni oluşum tahlilinin sonuçları, hücrelerin PACT ile shRNA işleminden sonra 2-3 kat koloniler oluşturduğunu gösterdi (Ek Şekil 3e).DARS-AS1'in PACT yoluyla hücre proliferasyonunu düzenleyip düzenlemediğini test etmek için PACT, DARS-AS1 veya her ikisini aşırı eksprese eden SW620 hücreleri oluşturduk.PACT'ın aşırı ekspresyonu, hücre proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 3i).DARS-AS1 aşırı ekspresyonu, hücre proliferasyonunu önemli ölçüde teşvik ederken, DARS-AS1 ve PACT'ı aşırı eksprese eden hücrelerin büyüme hızında önemli bir fark yoktu.Bu sonuçlar, PACT'ın DARS-AS1 aşırı ekspresyonunun neden olduğu artan proliferasyona karşı koyabileceğini göstermektedir.
DARS-AS1'in farklı bölgeleri farklı PACT bağlama yeteneklerine sahip olduğundan, DARS-AS1 fragmanlarının farklı aşırı ekspresyonu ile hücre proliferasyonu üzerindeki nispi etkilerini araştırdık.Diğer iki fragmanla karşılaştırıldığında, DARS-AS1, DARS-AS1'de hücre proliferasyonunu uyarma konusunda en yüksek yeteneğe sahip olan ana PACT ile ilgili bölge olan 3' ucunda (384-768 nt) aşırı eksprese edildi (Şekil 3j).Bu sonuçlar, DARS-AS1'in bağlanma kapasitesi ile biyolojik işlevi arasında pozitif bir ilişki olduğunu göstermektedir.
PACT'ın proapoptotik bir protein olduğu rapor edilmiştir19.Bu nedenle, DARS-AS1'in apoptoz üzerindeki etkisini araştırdık.Beklendiği gibi, DARS-AS1 yıkımı, SW620 hücrelerinde PARP bölünmesini önemli ölçüde arttırdı ve SW620, HCT116, HepG2 ve MBA-MD-231 hücre hatlarında anneksin V-pozitif hücrelerin oranını arttırdı (Şekil 3k).3).3f-h), DARS-AS1'in kanser hücrelerindeki anti-apoptotik etkisinin, PACT'ın apoptozu indükleyen fonksiyonunun tersi olduğunu gösterir.Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar DARS-AS1 onkojenik fonksiyonunun mekanizmasının PACT fonksiyonunun inhibisyonu yoluyla olabileceğini düşündürmektedir.
Daha sonra, DARS-AS1-PACT birlikteliğinin işlevsel etkilerini araştırdık.PACT'nin, daha sonra eIF2a fosforilasyonunu artıran, translasyonel silme ve apoptoza neden olan doğrudan etkileşim yoluyla PKR'yi aktive ettiği bildirilmiştir17.İlk olarak, DARS-AS1'in PACT ve PKR'nin hücresel lokalizasyonunu etkileyip etkilemediğini inceledik.Konfokal floresan mikroskopisi, PACT ve PKR'nin, ortalama Pearson korelasyon katsayısı 0.72 olan SW620 hücrelerinde yüksek oranda ortak lokalize olduğunu gösterdi.Bu arada, DARS-AS1 aşırı ekspresyonu, PACT ve PKR ortak lokalizasyonunu önemli ölçüde azalttı (ortalama Pearson korelasyon katsayısı 0.61) (Şekil 4a).DARS-AS1'in PACT-PKR etkileşimini modüle edip edemediğini araştırmak için, SW620 hücre lizatlarında anti-PACT antikoru ile bir birlikte immünopresipitasyon (co-IP) deneyi yaptık.PKR, kontrol hücrelerinde anti-PACT açısından yüksek oranda zenginleşirken, DARS-AS1'i aşırı eksprese eden hücrelerden alınan lizatlarda PKR geri kazanımı önemli ölçüde azaldı (Şekil 4b).In vitro protein bağlama deneyleri için saflaştırılmış etiketli PACT ve PKR kullanıldı.Buna göre, DARS-AS1 sağlayan ancak kontrol RNA'sı olmayanlar, bastırılmış PACT-PKR etkileşimi gösterdi (Şekil 4c).Tüm sonuçlar, DARS-AS1'in PACT ve PKR iletişimini bozduğunu gösterdi.
Kontrol hücrelerinde veya DARS-AS1'i aşırı eksprese eden hücrelerde PACT ve PKR'nin birlikte lokalizasyonu, konfokal floresan mikroskobu kullanılarak gözlendi.Çekirdekler DAPI ile boyandı.16 fotoğraftan istatistiksel sonuçlar elde edildi.b Kontrol SW620 hücrelerinin hücre lizatlarında veya DARS-AS1'i aşırı eksprese eden hücrelerde anti-PACT antikoru kullanılarak birlikte immünopresipitasyon (ko-IP).c Etiketli PACT, saflaştırılmış PKR ve DARS-AS1 veya sahte RNA ile in vitro kopyası in vitro protein bağlama analizi için inkübe edildi.İmmünopresipitasyon için anti-bayrak antikorları kullanıldı.d Belirtilen antikorlara sahip immünoblotlar, kontrol shRNA veya DARS-AS1-shRNA ile transfekte edilmiş SW620 ve HCT116 hücrelerinde gerçekleştirildi ve ardından serum aç bırakıldı.e DARS-AS1 ekspresyon seviyeleri, thapsigargin'e karşı hücresel duyarlılığı değiştirmiştir.SW620 hücreleri, DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 aşırı ekspresyon plazmidi veya kontrol plazmidi ile transfekte edildi.Hücreler, 48 saat boyunca thapsigargin ile işleme tabi tutuldu ve MTS reaktifi kullanılarak hücre canlılığı belirlendi.f İn vitro olarak kopyalanmış DARS-AS1 veya sahte RNA ve saflaştırılmış PACT, in vitro aktivasyon tahlili ve immünoblot tespiti için kullanıldı.g Bu antikorları kullanan immünoblotlar, SW620-ctrl hücreleri (solda) veya PKR mutantlarını aşırı eksprese eden hücreler (sağda) üzerinde gerçekleştirildi.Bu hücreler daha sonra kontrol shRNA veya DARS-AS1-shRNA ile transfekte edildi, ardından serum aç bırakıldı.h Akış sitometrisi, mutant PKR'nin etkisizleştirilmesinin, SW620 hücrelerinde DARS-AS1'in neden olduğu apoptozu telafi ettiğini gösterdi.i Belirtilen antikorlara sahip immünoblotlar, SW620 (sol) veya HCT116 (sağ) hücrelerinde gerçekleştirilmiştir.Kontrol shRNA veya DARS-AS1 shRNA ile transfekte edilmiş hücreler serumdan yoksundur ve 100 nM PKR C16 inhibitörü veya DMSO ile desteklenir.Ölçek çubuğu = 5 µm.Gösterilen veriler, üç deneyin ortalama ± standart sapmasıdır.* p ≤ 0.05 iki kuyruklu Student t testi.
Genel olarak, PACT'nin PKR17 ile etkileşime girdiğinde, Thr451'de PKR fosforilasyonunun indüklenebileceğine inanılmaktadır.Sonuçlarımız, serum açlığından sonra DARS-AS1 nakavt hücrelerinde PKR fosforilasyon seviyesinin önemli ölçüde yükseldiğini gösterdi (Şekil 4d ve Ek Şekil 4a).Buna göre, ana PKR substratı olan eIF2a'nın fosforilasyonunun da DARS-AS1 shRNA tarafından önemli ölçüde arttırıldığını bulduk (Şekil 4d ve Ek Şekil 4a).Thapsigargin, ER'nin Ca2+ salmasına neden olan bir ER stres etkenidir.Thapsigargin ile tedavinin, PKR ile etkileşime giren ve PKR'yi aktive eden, eIF2a fosforilasyonunu 18,61 artırarak apoptoza yol açan PACT'ın ekspresyonunu ve aktivasyonunu indüklediği bildirilmiştir.Burada, DARS-AS1'in hücrelerin PACT/PKR yolunu inhibe ederek stresin üstesinden gelmesine yardımcı olup olamayacağını araştırmak için PACT/PKR yolunun uyarıcısı olarak thapsigargin kullandık.DARS-AS1 ekspresyon seviyesinin, thapsigargin'e karşı hücre direnci ile pozitif korelasyon gösterdiğini gözlemledik.DARS-AS1'i aşırı eksprese eden SW620 hücreleri, thapsigargin ile tedavi edildiğinde daha iyi hayatta kalırken, DARS-AS1 yıkımına sahip hücreler daha duyarlı hale geldi (Şekil 4e).Bu sonuçlarla uyumlu olarak, DARS-AS1 aşırı ekspresyonu, thapsigargin kaynaklı PKR fosforilasyonunu azalttı (Ek Şekil 4b).Buna karşılık, thapsigargin işleminden sonra, PKR ve eIF2a, DARS-AS1 nakavt hücrelerinde kontrol hücrelerine kıyasla daha yüksek oranda fosforile edildi (Ek Şekil 4b).İlginç bir şekilde, thapsigargin, DARS-AS1'in bir anti-stres fonksiyonunu gösterebilen doza bağlı bir şekilde DARS-AS1 ekspresyonunu indükledi (Ek Şekil 4c).Ek olarak, bu gözlemleri doğrulamak için in vitro aktivasyon deneyleri gerçekleştirdik.Kısaca, PKR, bir anti-PKR antikoru kullanılarak hücre lizatlarından saflaştırıldı, daha sonra rekombinant PACT ile inkübe edildi ve in vitro kopyalanan DARS-AS1.Enzimatik reaksiyondan sonra, WB kullanılarak fosfo-PKR saptandı.Sonuçlarımız, PKR fosforilasyonunun DARS-AS1 tarafından önemli ölçüde inhibe edildiğini, ancak kontrol RNA'sı tarafından olmadığını gösterdi (Şekil 4f).Bu in vitro ve in vivo sonuçlar, DARS-AS1'in PACT aracılı PKR aktivasyonunu inhibe ettiğini göstermektedir.Aynı zamanda, DARS-AS1 varlığında PACT geri kazanımında da bir düşüş gözlemledik (Şekil 4f).Bu sonuç, in vitro protein bağlama testinin sonuçları ile tutarlıdır (Şekil 4c) ve yine DARS-AS1'in PACT-PKR ilişkisi için bloke etme fonksiyonunu gösterir.
PACT'ın D3 alanındaki Ser246 ve Ser287, hücresel stres altında PKR aktivasyonu için gereklidir.Alanin için iki serin tortusunun ikamesi, stres yokluğunda PKR'yi aktive eden mutant PACT'ı (mutD) verdi ve alanin için ikame (mutA) protokolü tersine çevirdi.Bu alanın önemini DARS-AS1 ile doğrudan ilişki içinde gösterdiğimiz için, bu kalıntıların DARS-AS1 ile etkileşime girip giremeyeceğini test etmek için bu iki PACT mutantını oluşturduk.İlginç bir şekilde, her iki mutant da DARS-AS1'e bağlanma yeteneğini kaybetti (Ek Şekil 4d), bu, DARS-AS1 ile verimli etkileşim için PACT proteininin tam yapısının gerekli olabileceğini düşündürdü.
Ayrıca, sonuçlarımız ayrıca, DARS-AS1-shRNA'nın neden olduğu hücre proliferasyonu inhibisyonunun, baskın bir negatif PACT mutantının (PACTmutA) veya baskın bir negatif PKR mutantının (PKRmut) aşırı eksprese edilmesiyle kısmen restore edilebileceğini göstermektedir (Ek Şekil 4e. e).Dominant-negatif PKR mutantlarının aşırı ekspresyonu, DARS-AS1 yıkımının indüklediği PKR fosforilasyonunu ve ayrıca serumdan yoksun hücrelerde eIF2a fosforilasyonunu azalttı (Şekil 4g).Daha da önemlisi, DARS-AS1 yıkımının neden olduğu apoptotik hücrelerin oranı, PKRmut'u aşırı eksprese eden hücrelerde de azaldı (Şekil 4h ve Ek Şekil 4g).PKR kinaz aktivitesinin inhibisyonu, DARS-AS1 fonksiyonunu da bozar, çünkü sonuçlar, DARS-AS1 yıkımının, hücreler PKR'ye özgü bir C16 inhibitörü ile tedavi edildiğinde nadiren PKR ve eIF2a fosforilasyonunu tetiklediğini gösterdi (Şekil 4i ve Ek Şekil 4h).).Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız DARS-AS1'in en azından kısmen PACT aracılı PKR aktivasyonunu inhibe ederek hücre proliferasyonunu desteklediğini göstermektedir.
DARS-AS1'in tümörijenezdeki rolünü daha fazla araştırmak için bir fare ksenograft modeli kullanarak in vivo deneyler yaptık. Sonuçlar, DARS-AS1'in yıkılmasının farelerde tümör büyümesini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir (p değeri < 0.0001) (Şekil 5a). Sonuçlar, DARS-AS1'in yıkılmasının farelerde tümör büyümesini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir (p değeri < 0.0001) (Şekil 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Sonuçlar, DARS-AS1 yıkımının farelerde tümör büyümesini büyük ölçüde azalttığını göstermektedir (p değeri < 0.0001) (Şekil 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5). Sonuçlar, DARS-AS1 yıkımının farelerde tümör büyümesini önemli ölçüde azalttığını gösterdi (p değeri < 0.0001) (Şekil 5a).Böylece, DARS-AS1 yıkım grubunda, ortalama tümör hacminde yaklaşık %72.9 ve ortalama tümör kütlesinde yaklaşık %87.8 oranında önemli bir azalma olmuştur (Şekil 5b-d).Bu sonuçlar, DARS-AS1'in in vivo olarak tümör büyümesini önemli ölçüde destekleyebileceğini kuvvetle önerir.
Çıplak farelerde reklam DARS-AS1 yıkımının kolorektal onkogenez üzerindeki etkileri.Büyüme eğrileri (a), tümör boyutu (b), ağırlık (c) ve tümör görüntüleri (d) gösterilmektedir.Hata çubukları ±SEM'i temsil eder. n = 10. ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t testi ile. n = 10. ****p < 0.0001, iki kuyruklu Student t testi ile. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 iki kuyruklu Student t testi.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 iki kuyruklu Student t testi.e Kaplan-Meier, UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ve LGG'li hastalarda DARS-AS1 ekspresyon seviyeleri ile genel sağkalım arasındaki korelasyonu analiz etti.Hastalarda yüksek düzeyde DARS-AS1 ekspresyonu ilk %50'deydi;hastalarda düşük DARS-AS1 ekspresyonu seviyesi en alttaki %50 idi.p değerleri log rank testi kullanılarak belirlendi.f DARS-AS1'in PACT-PKR yolunu ve tümör büyümesini düzenlediği önerilen model.
DARS-AS1'in klinik etkisini daha iyi anlamak için ekspresyonu ile hasta sağkalımı arasındaki korelasyonu inceledik.TCGA veri setini analiz ederek, daha yüksek DARS-AS1 ekspresyonunun uvea melanomu (UVM), renal kromofobi (KICH), renal papiller hücreli karsinom (KIRP), mezotelyoma (MESO), multipleks ile ilişkili olduğunu bulduk.Daha düşük sağkalım, glioblastoma morfozu (GBM) ve düşük dereceli beyin glioması (LGG) olan hastalar ile önemli ölçüde ilişkiliydi (Şekil 5e).Bu sonuçlar, DARS-AS1'in klinik tümör ilerlemesinde önemli bir rol oynayabileceğini ve çoklu kanserlerde potansiyel bir öngörücü biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmada, büyük ölçekli CRISPRi fonksiyonel tarama kullanarak, DARS-AS1 lncRNA'nın iki anahtar stres yanıtlayıcı PACT ve PKR'yi düzenleyerek kanser hücresi stresinin üstesinden geldiğini belirledik.Doğrudan PACT ile etkileşime girerek, DARS-AS1, PACT aracılı PKR aktivasyonunu inhibe etti, böylece apoptotik hücre ölümünü önledi ve hücre proliferasyonunu teşvik etti (Şekil 5f).DARS-AS1'in yukarı regülasyonu, birçok kanser türünde gözlemlenmiştir; bu, stresli koşullar altında kanser hücresinin hayatta kalmasını sağlama işlevinin, birden fazla kanser türüne geniş çapta uygulanabileceğini düşündürmektedir.
PACT, bir PKR aktivatör proteini olarak tanımlanmıştır ve PACT aracılı PKR aktivasyonu, transkripsiyon, translasyon, apoptoz ve diğer önemli hücresel süreçleri düzenleyerek stres yanıtlarında önemli bir rol oynar62.Onlarca yıldır PACT-PKR kaskadının kansere özgü düzenlemesini anlamak için girişimlerde bulunulmuştur.Burada, çalışmamız, PACT'a doğrudan bağlanan, PACT-PKR etkileşimini bloke eden, PKR aktivasyonunu ve eIF2a fosforilasyonunu inhibe eden, böylece stres kaynaklı apoptozu inhibe eden hücresel lncRNA DARS-AS1 yoluyla kanser hücrelerinde PACT-PKR'nin farklı bir düzenleme mekanizmasını ortaya çıkardı. nihai kanser proliferasyonunu uyarır.hücreler.Bu keşif, kanser prognozu ve tedavisi için potansiyel lncRNA hedeflerine ışık tutuyor.
Verilerimiz, DARS-AS1'in yıkılmasının, fosforile edilmiş PKR ve eIF2a'da önemli bir artışla hücreleri serum açlığına duyarlı hale getirdiğini gösterdi.Bu sonuçlar, DARS-AS1'in, PACT/PKR aktivitesini inhibe ederek zorlu koşullar altında kanser hücresinin hayatta kalmasını desteklediğini göstermektedir.ASPACT ve nc886 gibi diğer bazı kodlamayan RNA'lar da PACT48 mRNA'yı aşağı regüle ederek veya PKR49,50,64'e bağlanarak otofosforilasyonu düzenleyerek PACT/PKR ekseninde yer alır.Bunlar arasında DARS-AS1, PACT-PKR birliğinin bozucusu olarak hareket eder.Bu çalışma, PACT/PKR eksen düzenlemesi anlayışımızı ve lncRNA'ların stres yanıtlarındaki rolünü zenginleştirmektedir.
PACT üç ayrı alan içerir.İlk iki dsRBD'nin her biri, PACT'ın PKR'ye yüksek afiniteli bağlanmasını sağlamak için yeterlidir, üçüncü alan (D3) ise in vitro ve in vivo PKR aktivasyonu için gereklidir.Çalışmamız, DARS-AS1'in tercihen D3 alanı ile etkileşime girdiğini gösterdi (Şekil 3h).LncRNA'nın (768 nükleotid) büyük boyutu göz önüne alındığında, D3'e bağlanan DARS-AS1, dsRBD ve PKR'nin PACT alanı arasındaki etkileşimi fiziksel olarak engelleyebilir, böylece PACT ve PKR ilişkisini bloke edebilir.D3'teki Ser246 ve Ser287'yi alanin veya aspartat ile değiştiren PACT noktası mutasyonları, D3'ün genel yapısal ve elektriksel özelliklerinin birlikteliklerindeki önemine işaret ederek, onun DARS-AS1'e bağlanma afinitesini bozmuştur.Gelecekte daha kesin biyokimyasal analiz ve yüksek çözünürlüklü PACT yapısal analizi kullanılarak bu mekanizmanın daha fazla detayına ihtiyaç duyulacaktır.
Önceki çalışmalar, DARS-AS1'in çeşitli mekanizmalar yoluyla hücre çoğalmasını desteklediğini bildirmiştir51,52,53.Bir örnekte, araştırmacılar, DARS-AS1'in, böbrek kanseri hücrelerinde miP-194-5p'yi hedefleyerek antisens protein kodlayan DARS genini yukarı regüle ettiğini gözlemlediler.Bununla birlikte, bu çalışmada, DARS-AS1 yıkımının, en azından kolorektal, meme ve karaciğer kanserleri dahil olmak üzere birçok kanser türünde DARS transkripsiyonu üzerinde çok az etkisi oldu.LncRNA'lar hücre ve dokuya özgü ekspresyon paternleri sergilediğinden, kanser türleri arasında fonksiyonel mekanizmalar korunmayabilir, bu da gözlemlerimiz ile farklı kanserlerin önceki değerlendirmeleri arasındaki bu farklılığa katkıda bulunabilir.Çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerin spesifik mekanizmalarını aydınlatmak için özel çalışmalara ihtiyaç vardır.
Klinik verilerin bir analizi, tümörlerde DARS-AS1 ekspresyonunun kanser hastalarının sağkalımı ile ters orantılı olduğunu gösterdi ve bu, kanser prognozunda DARS-AS1/PACT/PKR ekseninin öneminin altını çiziyor.Sonuç olarak, çalışmamız, DARS-AS1'in PACT/PKR sinyal ekseninin düzenleyicisi olduğunu, kanser hücresi proliferasyonunu desteklediğini ve stres yanıtı sırasında apoptozu engellediğini göstermektedir, bu da başka bir araştırma hattı sağlar ve potansiyel tedavilere yönelik gelecekteki araştırmalar için ilgi çekicidir. .
İnsan hücre hatları SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ve HEK293T, Çin'deki Ulusal Hücre Hattı Kaynak Altyapısından elde edildi.Tüm hücreler, %10 FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ve %1 penisilin-streptomisin (Thermo Fisher Scientific) ile desteklenmiş DMEM ortamında (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 37°C'de, %5 CO2'de tutuldu.kuluçka makinesi.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Bayrak Önleyici, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubulin, CST (2128);normal fare IgG, CST (5415S);normal tavşan IgG, CST (2729S).Antikorlar, Western blot için PBST içinde 1:1000 ve IP için 1:100 oranında seyreltildi.
sgRNA'lar, CRISPR-ERA66 adlı halka açık bir araç kullanılarak geliştirildi.sgRNA geliştirme için varsayılan araç parametrelerini ve 3 kb bölgesindeki algoritma hesaplanan sgRNA bağlama sitelerini kullandık.TSS merkezli.sgRNA oligonükleotitlerinin havuzları CustomArray, Inc.'de (Bothewell, WA) sentezlendi ve hümanize pgRNA plazmitlerine klonlandı (Addgene #44248).Toplam 12 ug havuzlanmış hümanize pgRNA plazmiti, 7,2 ug psPAX2 (Addgene #12260) ve 4,8 ug pMD2.G (Addgene #12259) DNAfect Transfection Reagent kullanılarak 10 cm tabaklarda 5 x 106 HEK293T'ye birlikte transfekte edildi Üreticinin talimatlarını izleyerek hücreler (CWBIO, Beijing, China).Virüs içeren süpernatanlar, transfeksiyondan 48 ve 72 saat sonra toplandı ve 0.45 um'lik bir filtreden süzüldü.Tarama için, dCas9/KRAB füzyon proteinini eksprese eden SW620 hücreleri, virüs transdüksiyonu ile elde edildi.Modifiye edilmiş SW620 hücreleri, 0.1-0.3'lük bir MOI'de dört bağımsız enfeksiyon deneyinde virüs kütüphanesi ile enfekte edildi ve 2 gün boyunca 2 ug/ml puromisin (Sigma, St. Louis, MO) ile örneklendi.Daha sonra hücreler, tarama için minimum 500 hücre/sgRNA kütüphane kapsamı ile 18 gün boyunca in vitro olarak kültürlendi.
Genomik DNA, QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Almanya; 51183) talimatlarına göre ekstre edildi.Toplamda, kütüphaneyi oluşturmak için biyolojik tekrar başına 100 μg genomik DNA kullanıldı.sgRNA bölgesi, iki tur PCR ile büyütüldü ve bir barkoda bağlandı.
PCR ürünleri, NucleoSpin® jel ve PCR saflaştırma kiti (MACHEREY-NAGEL, Düren, Almanya; 740609.250) kullanılarak saflaştırıldı ve Qubit™ HS çift sarmallı DNA saptama kiti (Thermo Fisher Scientific; Q32854) kullanılarak nicelendirildi.
MTS tahlili, hücre çoğalmasını ölçmek için kullanıldı.Hücreler, 2000 hücre/çukurluk bir başlangıç ​​yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara ekildi.Göreceli hücre sayısı, toplam 4-6 gün boyunca belirtilen zamanda günlük olarak ölçülmüştür.Her oyuk için 20 ul MTS reaktifi (Promega), 100 ul DMEM ile seyreltildi, hücrelerle 4 saat 37°C'de inkübe edildi ve ardından OD490 ölçüldü.
Bağlantısız büyüme kapasitesi, kürelerin oluşumunu analiz ederek keşfedildi.Kısaca, shRNA DARS-AS1 veya kontrol shRNA ile transfekte edilmiş 2000 hücre, her 4 günde bir orta değişiklikle ultra düşük ek mikroplakalarında (Corning) kültürlendi.Sferoidler 14 gün sonra sayıldı.DARS-AS1 aşırı ekspresyon plazmidi veya bir kontrol plazmidi ile transfekte edilmiş 500 hücre, geliştirme deneyi için kullanıldı, aksi takdirde yöntem değişmedi.
RNA, Riboprobe® Kombinasyon Sistemlerinin (Promega P1440) talimatlarına göre T7 RNA polimeraz ve biotin-16-UTP (Roche 1138908910) kullanılarak kopyalandı.Burada kullanılan primerler Ek Tablo 4'te listelenmiştir.
Protein kodlayan PACT veya PKR bölgeleri, pET15b'ye (Addgene #73619) klonlandı ve BL21(DE3)'e dönüştürüldü.Bakteriler, ampisilin ile sağlanan LB içinde gece boyunca inkübe edildi ve daha sonra taze LB ile 100 kat seyreltildi.Ortamın OD600'ü 0.8'e ulaştığında, protein ekspresyonunu indüklemek için 1 mM IPTG ilave edildi.Hafif çalkalama ile gece boyunca inkübasyondan sonra (20°C'de 250 rpm), hücre peleti santrifüjleme (4000 rpm, 10 dakika, 4°C) ile toplanmıştır.Hücre peletini lizis tamponunda (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından sonikasyon (15 dakika, 5 s açık/kapalı, buz üzerinde) ve santrifüjleyin (13,000 rpm)., 30 dak, 4°С).Süpernatan daha sonra 4°C'de 3 kez Ni-NTA reçinesi (QIAGEN) üzerine yüklendi, 4 kez yıkama tamponu (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) ile yıkandı ve toplam 10 ml eluent tamponu (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Saflaştırılmış protein, WB kullanılarak belirlendi ve konsantrasyon, Qubit™ protein tahlil kiti (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) kullanılarak belirlendi.
RIP deneyleri, daha önce tarif edildiği gibi, modifikasyonlarla yapıldı.Kısaca, 1x RIP tamponu (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, %0.5 NP-40, RNasin ribonükleaz inhibitörü (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaz) sitostatik 1 x 107 kokteyli parçalar (Roche, 1 mM DTT) ve 4 °C'de 15 dakika 13.000 rpm'de santrifüjleyin.Süpernatan daha sonra 5 ug anti-PACT antikoru (Abeam) veya IgG (CST) ile konjuge protein A+G manyetik boncuklar (Millipore) ile inkübe edildi.Boncuklar 5 kez 5x RIP tamponu ile yıkandı, daha sonra proteinaz K (NEB) ile sindirildi.RNA, Trizol ile ekstre edildi ve RT-qPCR ile belirlendi.Primerler Ek Tablo 5'te sunulmuştur.
İn vitro RIP tahlili, modifiye edilmiş bir standart RIP tahlili protokolüne göre gerçekleştirilmiştir.Toplam 5 pmol in vitro kopyalanmış RNA, 1x RIP tamponu ile seyreltildi ve 65°C'de 5 dakika inkübasyon ve ardından oda sıcaklığına yavaş soğutma ile tavlandı.Toplam 5 pmol bozulmamış veya mutasyona uğramış bayrak etiketli PACT proteini, E. coli'den saflaştırıldı.4°C'de 2 saat boyunca renatüre RNA ile inkübe edin ve anti-bayrak IP için RIP analizi için yukarıdaki prosedürü izleyin.
RNA uzatma analizi için 1x107 hücre, 1xRIP tamponu ile parçalandı.4°C'de 15 dakika 13.000 rpm'de santrifüj edildikten sonra, süpernatan, 4°C'de 2 saat 30 ul streptavidin manyetik boncuklar (Beckman) ile ön işleme tabi tutuldu.Saflaştırılan lizat daha sonra maya tRNA'sı ile sağlandı ve gece boyunca 4°C'de 40 pmol renatüre RNA ile inkübe edildi, ardından 2 saat daha inkübe edildi ve BSA ile bloke edilmiş 20 ul yeni streptavidin manyetik boncuklar ilave edildi.Yıkama aşaması, 5x RIP tamponlu 4 defa ve 1x RIP tamponlu 4 defadan oluşuyordu.Karşılık gelen proteinler, biyotin elüsyon tamponu (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ile ayrıştırıldı ve NuPAGE %4-12 Bis-Tris Gel (Invitrogen) üzerinde ayrıldı.Gümüş boyamadan sonra (Beyotime Biotechnology), belirli bantlar eksize edildi ve MS ile analiz edildi.
PACT ve PKR arasındaki etkileşimi test etmek için Co-IP analizi yapıldı.Kısaca, süpernatan lizatları, 1 x 107 parçalanmış hücrenin 1 x RIP tamponu içinde inkübe edilmesi ve ardından 4°C'de 15 dakika boyunca 13.000 rpm'de santrifüjlenmesiyle hazırlandı.Lizatlar, protein A + G manyetik boncuklarla yüklendi, 5 ug anti-PACT antikoru ile konjuge edildi ve gece boyunca 4°C'de hafifçe döndürüldü.Boncuklar 3 kez 5xRIP tamponu ile, iki kez 1xRIP tamponu ile yıkandı ve 1xSDS tamponu ile ayrıştırıldı.Geri kazanılan protein, SDS-PAGE jeli ile analiz edildi ve WB ile tespit edildi.
İki pmol işaretli PACT ve 1 pmol PKR, E. coli'den saflaştırıldı.1 × RIP tamponunda seyreltin ve 4 °C'de 2 saat boyunca 10 pmol renatüre RNA ile inkübe edin.Bundan sonra, iki saat daha protein A+G manyetik boncuk konjuge anti-etiketli antikor ile inkübe edildiler.Boncuklar daha sonra 1x RIP tamponu ile dört kez yıkandı ve 1x SDS tamponu ile ayrıştırıldı.Ortaya çıkan PACT ve PKR, WB tarafından tespit edildi.