Haberler

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, desteğin devam etmesini sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Etkili ışığa duyarlılaştırıcılar, fototerapinin yaygın klinik kullanımı için özellikle önemlidir.Bununla birlikte, geleneksel ışığa duyarlılaştırıcılar genellikle kısa dalga boyu absorpsiyonundan, yetersiz fotostabiliteden, reaktif oksijen türlerinin (ROS) düşük kuantum veriminden ve kümelenmenin neden olduğu ROS sönmesinden muzdariptir.Burada, sulu çözelti içinde Ru(II)-aren organometalik komplekslerinin kendiliğinden birleşmesi ile aracılık edilen bir yakın-kızılötesi (NIR) supramoleküler ışığa duyarlılaştırıcı (RuDA) rapor ediyoruz.RuDA, kümelenmiş halde yalnızca singlet oksijen (1O2) üretebilir ve singlet-triplet sistemi arasındaki çaprazlama sürecindeki önemli bir artıştan dolayı bariz agregasyon kaynaklı 1O2 oluşturma davranışı sergiler.808 nm lazer ışığının etkisi altında RuDA, %16,4'lük bir 1O2 kuantum verimi (FDA onaylı indosiyanin yeşili: ΦΔ=0,2) ve mükemmel fotostabilite ile %24,2'lik yüksek bir fototermal dönüşüm verimliliği (ticari altın nanoçubuklar) sergiler.: %21.0, altın nanokabuklar: %13.0).Ek olarak, iyi biyouyumluluğa sahip RuDA-NP'ler, tercihen tümör bölgelerinde birikebilir ve fotodinamik tedavi sırasında tümör hacminde in vivo %95.2'lik bir azalma ile önemli tümör gerilemesine neden olabilir.Bu kümelenmeyi artıran fotodinamik terapi, uygun fotofiziksel ve fotokimyasal özelliklere sahip ışığa duyarlılaştırıcılar geliştirmek için bir strateji sağlar.
Konvansiyonel terapi ile karşılaştırıldığında, fotodinamik terapi (PDT), doğru uzaysal-zamansal kontrol, non-invazivlik, ihmal edilebilir ilaç direnci ve yan etkilerin en aza indirilmesi gibi önemli avantajları nedeniyle kanser için çekici bir tedavidir 1,2,3.Işık ışıması altında, kullanılan ışığa duyarlılaştırıcılar, apoptoz/nekroz veya bağışıklık tepkilerine yol açan yüksek reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturmak üzere aktive edilebilir4,5. Bununla birlikte, klorinler, porfirinler ve antrakinonlar gibi çoğu geleneksel ışığa duyarlı hale getiriciler, nispeten kısa dalga boyunda absorpsiyona sahiptir (frekans < 680 nm), bu nedenle biyolojik moleküllerin (örneğin hemoglobin ve melanin) yoğun absorpsiyonundan dolayı zayıf ışık penetrasyonu ile sonuçlanır. görünür bölge6,7. Bununla birlikte, klorinler, porfirinler ve antrakinonlar gibi çoğu geleneksel ışığa duyarlı hale getiriciler, nispeten kısa dalga boyunda absorpsiyona sahiptir (frekans < 680 nm), bu nedenle biyolojik moleküllerin (örneğin hemoglobin ve melanin) yoğun absorpsiyonundan dolayı zayıf ışık penetrasyonu ile sonuçlanır. görünür bölge6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Bununla birlikte, klorinler, porfirinler ve antrakinonlar gibi en yaygın ışığa duyarlılaştırıcılar, nispeten kısa dalga boyu absorpsiyonuna (< 680 nm) sahiptir ve bu da biyolojik moleküllerin (örneğin hemoglobin ve melanin) görünür bölgeye yoğun absorpsiyonu nedeniyle zayıf ışık penetrasyonuna neden olur6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率< 680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收，导致光穿透性差。然而 ， 传统 的 ， ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 ， ， （频率 频率 的 波长 吸收 频率 频率 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） ， ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Bununla birlikte, klorinler, porfirinler ve antrakinonlar gibi çoğu geleneksel ışığa duyarlılaştırıcılar, zayıf ışık penetrasyonuna neden olan hemoglobin ve melanin gibi biyomoleküllerin güçlü absorpsiyonundan dolayı nispeten kısa dalga boyu absorpsiyonuna (frekans < 680 nm) sahiptir.Görünür alan 6.7.Bu nedenle, 700-900 nm “terapötik pencerede” aktive olan yakın kızılötesi (NIR) emici ışığa duyarlılaştırıcılar, fototerapi için çok uygundur.Yakın kızılötesi ışık biyolojik dokular tarafından en az absorbe edildiğinden, daha derin penetrasyona ve daha az fotohasara yol açabilir8,9.
Ne yazık ki, mevcut NIR emici ışığa duyarlılaştırıcılar genellikle zayıf fotostabiliteye, düşük singlet oksijen (1O2) üretme kapasitesine ve klinik uygulamalarını sınırlayan agregasyon kaynaklı 1O2 söndürmeye sahiptir10,11.Geleneksel ışığa duyarlılaştırıcıların fotofiziksel ve fotokimyasal özelliklerini geliştirmek için büyük çabalar sarf edilmesine rağmen, şimdiye kadar birçok rapor, NIR emici ışığa duyarlılaştırıcıların tüm bu sorunları çözebileceğini bildirmiştir.Ek olarak, foton enerjisi IR'ye yakın bölgede hızla azaldığından, 800 nm'nin üzerindeki ışıkla ışınlandığında, birkaç ışığa duyarlılaştırıcı verimli 1O212,13,14 üretimi için umut vaat etmiştir.Elektron verici olarak trifenilamin (TFA) ve elektron alıcı grup olarak [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazin (TDP) verici-alıcı (DA) tipi boyarmaddeler bir sınıftır. Yakın kızılötesi biyogörüntüleme II ve fototermal terapi (PTT) için dar bant aralıkları nedeniyle kapsamlı bir şekilde çalışılan yakın kızılötesi emen boyaların .Bu nedenle, DA tipi boyalar, PDT için ışığa duyarlılaştırıcılar olarak nadiren çalışılmış olmalarına rağmen, IR'ye yakın uyarma ile PDT için kullanılabilir.
Işığa duyarlılaştırıcıların sistemler arası geçişinin (ISC) yüksek verimliliğinin 1O2 oluşumunu desteklediği iyi bilinmektedir.ISC sürecini ilerletmek için yaygın bir strateji, ağır atomlar veya özel organik parçalar ekleyerek ışığa duyarlılaştırıcıların spin-yörünge bağlantısını (SOC) geliştirmektir.Ancak, bu yaklaşımın hala bazı dezavantajları ve sınırlamaları vardır19,20.Son zamanlarda, supramoleküler kendi kendine bir araya gelme, fototerapide çok sayıda avantajla, moleküler düzeyde,21,22 fonksiyonel malzemelerin üretimi için aşağıdan yukarıya akıllı bir yaklaşım sağlamıştır: (1) kendi kendine monte edilen ışığa duyarlılaştırıcılar, şerit yapıları oluşturma potansiyeline sahip olabilir.Yapı blokları arasındaki örtüşen yörüngeler nedeniyle daha yoğun enerji seviyeleri dağılımına sahip elektronik yapılara benzer.Bu nedenle, alt tekli uyarılmış durum (S1) ile komşu üçlü uyarılmış durum (Tn) arasındaki enerji eşleşmesi iyileştirilecektir, bu da ISC işlemi 23, 24 için faydalıdır.(2) Supramoleküler montaj, aynı zamanda ISC sürecini 25, 26 destekleyen intramoleküler hareket sınırlama mekanizmasına (RIM) dayalı radyasyonsuz gevşemeyi azaltacaktır.(3) Supramoleküler düzenek, monomerin iç moleküllerini oksidasyon ve bozunmadan koruyabilir, böylece ışığa duyarlılaştırıcının fotostabilitesini büyük ölçüde iyileştirir.Yukarıdaki avantajlar göz önüne alındığında, supramoleküler ışığa duyarlılaştırıcı sistemlerin, PDT'nin eksikliklerinin üstesinden gelmek için umut verici bir alternatif olabileceğine inanıyoruz.
Ru(II) bazlı kompleksler, benzersiz ve çekici biyolojik özelliklerinden dolayı hastalıkların teşhis ve tedavisinde potansiyel uygulamalar için umut verici bir tıbbi platformdur28,29,30,31,32,33,34.Ek olarak, uyarılmış durumların bolluğu ve Ru(II)-tabanlı komplekslerin ayarlanabilir fotofizikokimyasal özellikleri, Ru(II)-tabanlı ışığa duyarlılaştırıcıların geliştirilmesi için büyük avantajlar sağlar35,36,37,38,39,40.Kayda değer bir örnek, kasa invaze olmayan mesane kanserinin (NMIBC) 41 tedavisi için bir ışığa duyarlılaştırıcı olarak şu anda Faz II klinik denemelerinde olan rutenyum(II) polipiridil kompleksi TLD-1433'tür.Ek olarak, rutenyum(II)aren organometalik kompleksleri, düşük toksisiteleri ve modifikasyon kolaylığı nedeniyle kanser tedavisi için kemoterapötik ajanlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır42,43,44,45.Ru(II)-aren organometalik komplekslerinin iyonik özellikleri, sadece DA kromoforlarının yaygın çözücülerdeki zayıf çözünürlüğünü iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda DA kromoforlarının montajını da geliştirir.Ek olarak, Ru(II)-arenlerin organometalik komplekslerinin psödooktahedral yarı sandviç yapısı, DA-tipi kromoforların H-agregasyonunu sterik olarak önleyebilir, böylece kırmızıya kaydırılmış absorpsiyon bantları ile J-agregasyonunun oluşumunu kolaylaştırabilir.Bununla birlikte, düşük stabilite ve/veya zayıf biyoyararlanım gibi Ru(II)-aren komplekslerinin doğal dezavantajları, aren-Ru(II) komplekslerinin terapötik etkinliğini ve in vivo aktivitesini etkileyebilir.Bununla birlikte, çalışmalar, rutenyum komplekslerinin biyouyumlu polimerlerle fiziksel kapsülleme veya kovalent konjugasyon yoluyla kapsüllenmesiyle bu dezavantajların üstesinden gelinebileceğini göstermiştir.
Bu çalışmada, DAD kromoforu ve Ru(II)-aren kısmı arasındaki bir koordinasyon bağı yoluyla bir NIR tetikleyicisi ile DA-konjuge Ru(II)-aren (RuDA) komplekslerini rapor ediyoruz.Ortaya çıkan kompleksler, kovalent olmayan etkileşimler nedeniyle suda metalosupramoleküler veziküller halinde kendi kendine birleşebilir.Özellikle, supramoleküler düzenek, RuDA'ya, PDT için çok uygun olan, ISC verimliliğini önemli ölçüde artıran polimerizasyon kaynaklı sistemler arası geçiş özellikleri kazandırdı (Şekil 1A).Tümör birikimini ve in vivo biyouyumluluğu artırmak için, FDA onaylı Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO), yüksek verimli bir PDT/Çift- mod PTT proxy'si .Kanser fototerapisinde (Şekil 1C), PDT ve PTT'nin in vivo etkinliğini incelemek için çıplak fareleri MDA-MB-231 tümörleri ile tedavi etmek için RuDA-NP kullanıldı.
Kanser fototerapisi için monomerik ve toplu formlarda RuDA'nın fotofiziksel mekanizmasının şematik gösterimi, NIR ile aktive olan PDT ve PTT için B RuDA-NP'ler ve C RuDA-NP'lerin sentezi.
TPA ve TDP işlevselliğinden oluşan RuDA, Ek Şekil 1'de (Şekil 2A) gösterilen prosedüre göre hazırlandı ve RuDA, 1H ve 13C NMR spektrumları, elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi ve element analizi (Ek Şekiller 2-4) ile karakterize edildi. ).En düşük singlet geçişinin RuDA elektron yoğunluk farkı haritası, yük transfer sürecini incelemek için zamana bağlı yoğunluk fonksiyonel teorisi (TD-DFT) ile hesaplandı.Ek Şekil 5'te gösterildiği gibi, elektron yoğunluğu, tipik bir molekül içi yük transferi (CT) geçişine atfedilebilen, foto-uyarmadan sonra esas olarak trifenilaminden TDP alıcı birime kayar.
Cevherin kimyasal yapısı B Çeşitli oranlarda DMF ve su karışımlarında Cevherin absorpsiyon spektrumları.C RuDA (800 nm) ve ICG'nin (779 nm) normalleştirilmiş absorpsiyon değerleri, 808 nm lazer ışığının 0,5 W cm-2'sinde zamana karşı.D ABDA'nın fotodegradasyonu, dalga boyu 808 nm ve gücü 0,5 W/cm2 olan lazer radyasyonunun etkisi altında farklı su içeriklerine sahip DMF/H2O karışımlarında RuDA kaynaklı 1O2 oluşumu ile gösterilir.
Özetçe—UV-görünür absorpsiyon spektroskopisi, çeşitli oranlarda DMF ve su karışımlarında Cevherin kendi kendine birleşme özelliklerini incelemek için kullanıldı.Şekilde gösterildiği gibi.2B'de, RuDA, 729 nm'de maksimum absorpsiyon bandı ile DMF'de 600 ila 900 nm arasında absorpsiyon bantları sergiler.Su miktarının arttırılması, Cevher absorpsiyonunun maksimum 800 nm'ye kademeli olarak kırmızıya kaymasına yol açtı; bu, monte edilmiş sistemdeki Cevherin J-agregasyonunu gösterir.RuDA'nın farklı çözücülerdeki fotolüminesans spektrumları, Ek Şekil 6'da gösterilmektedir. RuDA, maksimum emisyon dalga boyu ca olan tipik NIR-II ışıldama sergiliyor gibi görünmektedir.Sırasıyla CH2Cl2 ve CH30H içinde 1050 nm.RuDA'nın büyük Stokes kayması (yaklaşık 300 nm), uyarılmış durumun geometrisinde ve düşük enerjili uyarılmış durumların oluşumunda önemli bir değişiklik olduğunu gösterir.Cevherin CH2Cl2 ve CH3OH içindeki lüminesans kuantum verimleri sırasıyla %3.3 ve %0.6 olarak belirlendi.Bununla birlikte, bir metanol ve su karışımında (5/95, v/v), emisyonda hafif bir kırmızıya kayma ve kuantum veriminde (% 0.22) bir azalma gözlendi, bu da cevherin kendiliğinden bir araya gelmesinden kaynaklanabilir. .
CEVHER'in kendi kendine birleşmesini görselleştirmek için, su ekledikten sonra metanol çözeltisindeki CEVHER'deki morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için sıvı atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullandık.Su içeriği %80'in altında olduğunda net bir agregasyon gözlenmedi (Ek Şekil 7).Bununla birlikte, su içeriğinde %90-95'e kadar daha fazla bir artışla, cevherin kendiliğinden toplandığını gösteren küçük nanopartiküller ortaya çıktı.Ayrıca, 808 nm dalga boyuna sahip lazer ışınımı, RuDA'nın sulu ortamda absorpsiyon yoğunluğunu etkilemedi. çözüm (Şekil 2C ve Ek Şekil 8).Buna karşılık, indosiyanin yeşilinin (kontrol olarak ICG) absorbansı 779 nm'de hızla düşerek RuDA'nın mükemmel fotostabilitesini gösterir.Ek olarak, RuDA-NP'lerin PBS (pH = 5.4, 7.4 ve 9.0), %10 FBS ve DMEM (yüksek glikoz) içindeki stabilitesi, çeşitli noktalarda UV-görünür absorpsiyon spektroskopisi ile incelendi.Ek Şekil 9'da gösterildiği gibi, RuDA-NP'nin mükemmel stabilitesini gösteren pH 7.4/9.0, FBS ve DMEM'de PBS'de RuDA-NP absorpsiyon bantlarında hafif değişiklikler gözlendi.Ancak asidik bir ortamda (рН = 5.4) Cevherin hidrolizi bulundu.Ayrıca yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemlerini kullanarak RuDA ve RuDA-NP'nin stabilitesini de değerlendirdik.Ek Şekil 10'da gösterildiği gibi, RuDA ilk saat boyunca metanol ve su (50/50, v/v) karışımı içinde stabildi ve 4 saat sonra hidroliz gözlendi.Bununla birlikte, RuDA NP'leri için yalnızca geniş bir içbükey-dışbükey tepe gözlemlendi.Bu nedenle, RuDA NP'lerinin PBS'deki (pH = 7.4) stabilitesini değerlendirmek için jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) kullanıldı.Ek Şekil 11'de gösterildiği gibi, test edilen koşullar altında 8 saatlik inkübasyondan sonra, NP RuDA'nın pik yüksekliği, pik genişliği ve pik alanı önemli ölçüde değişmedi, bu da NP RuDA'nın mükemmel stabilitesini gösterir.Ek olarak, TEM görüntüleri, RuDA-NP nanoparçacıklarının morfolojisinin, seyreltilmiş PBS tamponunda 24 saat sonra neredeyse değişmeden kaldığını gösterdi (pH = 7.4, Ek Şekil 12).
Kendi kendine bir araya gelme, Cevher üzerine farklı fonksiyonel ve kimyasal özellikler kazandırabileceğinden, metanol-su karışımlarında 9,10-antrasendiilbis(metilen)dimalonik asit (ABDA, gösterge 1O2) salınımını gözlemledik.Farklı su içeriğine sahip cevher50.Şekil 2D ve Ek Şekil 13'te gösterildiği gibi, su içeriği %20'nin altında olduğunda ABDA'da herhangi bir bozulma gözlenmedi.Nemin %40'a yükselmesiyle, ABDA floresan yoğunluğunun azalmasıyla kanıtlandığı gibi ABDA bozulması meydana geldi.Ayrıca, daha yüksek su içeriğinin daha hızlı bozunma ile sonuçlandığı gözlemlenmiştir, bu da RuDA'nın kendi kendine montajının ABDA bozunması için gerekli ve faydalı olduğunu düşündürmektedir.Bu fenomen, modern ACQ (toplanma kaynaklı söndürme) kromoforlarından çok farklıdır.808 nm dalga boyuna sahip bir lazerle ışınlandığında, %98 H2O/%2 DMF karışımındaki 1O2 RuDA'nın kuantum verimi %16.4'tür, bu da ICG'ninkinden 82 kat daha yüksektir (ΦΔ = %0.2)51, Toplama durumunda dikkate değer bir üretim verimliliği gösteren 1O2 RuDA.
Döndürme tuzakları olarak 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinon (TEMP) ve 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksit (DMPO) kullanılarak elektron döndürmeleri Elde edilen türleri tanımlamak için rezonans spektroskopisi (ESR) kullanıldı AFK.RuDA tarafından.Ek Şekil 14'te gösterildiği gibi, 0 ila 4 dakika arasındaki ışınlama sürelerinde 1O2 üretildiği doğrulanmıştır.Ek olarak, RuDA ışınlama altında DMPO ile inkübe edildiğinde, hidroksil radikallerinin (OH·) oluşumunu gösteren 1:2:2:1 DMPO-OH· eklentisinin tipik bir dört satırlı EPR sinyali saptandı.Genel olarak, yukarıdaki sonuçlar RuDA'nın ikili tip I/II ışığa duyarlı hale getirme işlemi yoluyla ROS üretimini uyarma yeteneğini göstermektedir.
RuDA'nın monomerik ve kümelenmiş formlardaki elektronik özelliklerini daha iyi anlamak için, RuDA'nın monomerik ve dimerik formlardaki sınır moleküler orbitalleri DFT yöntemi kullanılarak hesaplandı.Şekilde gösterildiği gibi.Şekil 3A'da, monomerik RuDA'nın en yüksek dolu moleküler orbitali (HOMO), ligand omurgası boyunca delokalize edilir ve en düşük boş moleküler orbital (LUMO), TDP alıcı biriminde merkezlenir.Aksine, dimerik HOMO'daki elektron yoğunluğu bir RuDA molekülünün ligandı üzerinde yoğunlaşırken, LUMO'daki elektron yoğunluğu esas olarak başka bir RuDA molekülünün alıcı birimi üzerinde yoğunlaşmıştır, bu da RuDA'nın dimerde olduğunu gösterir.CT'nin özellikleri.
A Cevherin HOMO ve LUMO'su monomerik ve dimerik formlarda hesaplanır.B Cevherin monomer ve dimerlerdeki singlet ve triplet enerji seviyeleri.C Tahmini RuDA seviyeleri ve monomerik C ve dimerik D olarak olası ISC kanalları. Oklar, olası ISC kanallarını gösterir.
Monomerik ve dimerik formlarda RuDA'nın düşük enerjili singlet uyarılmış durumlarındaki elektron ve deliklerin dağılımı, TD-DFT yöntemi kullanılarak hesaplanan Multiwfn 3.852.53 yazılımı kullanılarak analiz edildi.Ek etikette belirtildiği gibi.Şekil 1-2'de gösterildiği gibi, monomerik RDA delikleri, bu singlet uyarılmış durumlarda çoğunlukla ligand omurgası boyunca yer değiştirirken, elektronlar çoğunlukla TDP grubunda yer alır ve CT'nin molekül içi özelliklerini gösterir.Ek olarak, bu singlet uyarılmış durumlar için, delikler ve elektronlar arasında aşağı yukarı örtüşme vardır, bu da bu singlet uyarılmış durumların yerel uyarmadan (LE) bir miktar katkı sağladığını düşündürür.Dimerler için, molekül içi CT ve LE özelliklerine ek olarak, moleküller arası CT analizine dayalı olarak, özellikle S3, S4, S7 ve S8 olmak üzere ilgili durumlarda moleküller arası CT özelliklerinin belirli bir oranı gözlendi, ana olanlar olarak CT moleküller arası geçişler (Ek Tablo).3).
Deneysel sonuçları daha iyi anlamak için, monomerler ve dimerler arasındaki farkları araştırmak için RuDA heyecanlı durumlarının özelliklerini daha da araştırdık (Ek Tablolar 4-5).Şekil 3B'de gösterildiği gibi, dimerin singlet ve triplet uyarılmış durumlarının enerji seviyeleri, monomerinkinden çok daha yoğundur, bu da S1 ve Tn arasındaki enerji boşluğunu azaltmaya yardımcı olur. ISC geçişlerinin S1 ve Tn54 arasındaki küçük enerji aralığı (ΔES1-Tn < 0.3 eV) içinde gerçekleştirilebileceği bildirilmiştir. ISC geçişlerinin, S1 ve Tn54 arasında küçük bir enerji aralığı (ΔES1-Tn < 0.3 eV) içinde gerçekleştirilebileceği bildirilmiştir. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-İzoT) <0,ES1-İzoTn ISC geçişlerinin S1 ve Tn54 arasında küçük bir enerji aralığı (ΔES1-Tn <0,3 eV) içinde gerçekleştirilebileceği bildirilmiştir.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, сто переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щелической щелической щели (ΔES1-Tэn S <54. ISC geçişinin, S1 ve Tn54 arasında küçük bir enerji aralığı (ΔES1-Tn < 0.3 eV) içinde gerçekleştirilebileceği bildirilmiştir.Ek olarak, sıfır olmayan bir SOC integrali sağlamak için yalnızca bir yörünge, dolu veya boş, bağlı tekli ve üçlü durumlarda farklılık göstermelidir.Bu nedenle, uyarma enerjisinin ve yörünge geçişinin analizine dayalı olarak, ISC geçişinin tüm olası kanalları Şek.3C,D.Özellikle, monomerde yalnızca bir ISC kanalı bulunurken, dimerik formda ISC geçişini geliştirebilen dört ISC kanalı bulunur.Bu nedenle, ne kadar çok RuDA molekülü toplanırsa, ISC kanallarının o kadar erişilebilir olacağını varsaymak mantıklıdır.Bu nedenle, RuDA agregaları singlet ve triplet hallerde iki bantlı elektronik yapılar oluşturarak S1 ve mevcut Tn arasındaki enerji boşluğunu azaltarak 1O2 üretimini kolaylaştırmak için ISC'nin verimliliğini arttırır.
Altta yatan mekanizmayı daha fazla açıklamak için, RuDA'da iki etil grubunu iki trifenilamin fenil grubuyla değiştirerek arene-Ru(II) kompleksinin (RuET) bir referans bileşiğini sentezledik (Tam karakterizasyon için Şekil 4A, bakınız ESI, Ek 15 -21 ) Vericiden (dietilamin) alıcıya (TDF) kadar, RuET, RuDA ile aynı molekül içi CT özelliklerine sahiptir.Beklendiği gibi, DMF'deki RuET'nin absorpsiyon spektrumu, 600-1100 nm bölgesinde yakın kızılötesi bölgede güçlü absorpsiyona sahip düşük enerjili bir yük transfer bandı gösterdi (Şekil 4B).Ek olarak, sıvı AFM görüntüleme ile daha da doğrulanan, maksimum absorpsiyonun kırmızıya kaymasına yansıyan artan su içeriği ile RuET toplanması da gözlendi (Ek Şekil 22).Sonuçlar, RuDA gibi RuET'nin de molekül içi durumlar oluşturabileceğini ve kümelenmiş yapılarda kendi kendine toplanabileceğini göstermektedir.
RuET'nin kimyasal yapısı.B Çeşitli oranlarda DMF ve su karışımlarında RuET'nin absorpsiyon spektrumları.RuDA ve RuET için C EIS Nyquist Arsaları.808 nm dalga boyuna sahip lazer radyasyonunun etkisi altında RuDA ve RuET'nin fotoakım tepkileri D.
ABDA'nın RuET varlığında fotodegradasyonu, 808 nm dalga boyuna sahip bir lazerle ışınlanarak değerlendirildi.Şaşırtıcı bir şekilde, çeşitli su fraksiyonlarında ABDA'nın bozulması gözlenmedi (Ek Şekil 23).Muhtemel bir sebep, etil zincirinin verimli moleküller arası yük transferini desteklemediği için RuET'in bantlı bir elektronik yapıyı verimli bir şekilde oluşturamamasıdır.Bu nedenle, RuDA ve RuET'nin fotoelektrokimyasal özelliklerini karşılaştırmak için elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ve geçici fotoakım ölçümleri yapıldı.Nyquist grafiğine göre (Şekil 4C), RuDA, RuET'den çok daha küçük bir yarıçap gösterir; bu, RuDA56'nın daha hızlı moleküller arası elektron taşınımına ve daha iyi iletkenliğe sahip olduğu anlamına gelir.Ek olarak, RuDA'nın fotoakım yoğunluğu RuET'ninkinden çok daha yüksektir (Şekil 4D), bu da RuDA57'nin daha iyi yük transfer verimliliğini doğrular.Bu nedenle, Cevherdeki trifenilamin fenil grubu, moleküller arası yük aktarımının sağlanmasında ve bantlı bir elektronik yapının oluşumunda önemli bir rol oynar.
Tümör birikimini ve in vivo biyouyumluluğu artırmak için RuDA'yı F127 ile daha da kapsülledik.RuDA-NP'lerin ortalama hidrodinamik çapı, geçirgenliği ve tutmayı artırarak tümör birikimini destekleyen dinamik ışık saçılımı (DLS) yöntemi (Şekil 5A) kullanılarak dar bir dağılımla (PDI = 0.089) 123.1 nm olarak belirlendi.EPR) etkisi.TEM görüntüleri, Cevher NP'lerinin ortalama çapı 86 nm olan düzgün bir küresel şekle sahip olduğunu gösterdi.Özellikle, RuDA-NP'lerin maksimum absorpsiyonunun 800 nm'de ortaya çıkması (Ek Şekil 24), RuDA-NP'lerin kendiliğinden monte edilen RuDA'ların fonksiyonlarını ve özelliklerini koruyabileceğini gösterir.NP Cevheri için hesaplanan ROS kuantum verimi, Cevher ile karşılaştırılabilir olan %15.9'dur RuDA NP'lerinin fototermal özellikleri, bir kızılötesi kamera kullanılarak 808 nm dalga boyuna sahip lazer radyasyonunun etkisi altında incelenmiştir.Şekilde gösterildiği gibi.5B,C'de, kontrol grubu (yalnızca PBS) sıcaklıkta hafif bir artış yaşarken, RuDA-NPs çözeltisinin sıcaklığı, artan sıcaklıkla (ΔT) 15.5, 26.1 ve 43.0°C'ye hızla yükseldi.Yüksek konsantrasyonlar, RuDA NP'lerinin güçlü bir fototermal etkisini gösteren sırasıyla 25, 50 ve 100 uM idi.Ek olarak, RuDA-NP'nin fototermal stabilitesini değerlendirmek ve ICG ile karşılaştırmak için ısıtma/soğutma döngüsü ölçümleri alındı.Cevher NP'lerinin sıcaklığı, Cevher NP'lerinin mükemmel fototermal stabilitesini gösteren beş ısıtma/soğutma döngüsünden sonra (Şekil 5D) düşmedi.Buna karşılık, ICG, aynı koşullar altında fototermal sıcaklık platosunun görünür şekilde kaybolmasından görüldüğü gibi daha düşük fototermal stabilite sergiler.Önceki yönteme58 göre, RuDA-NP'nin fototermal dönüşüm verimliliği (PCE) %24,2 olarak hesaplanmıştır ki bu, altın nanoçubuklar (%21.0) ve altın nanokabuklar (%13.0)59 gibi mevcut fototermal malzemelerden daha yüksektir.Böylece, NP Cevheri, onları umut verici PTT ajanları yapan mükemmel fototermal özellikler sergiler.
RuDA NP'lerinin (iç metin) DLS ve TEM görüntülerinin analizi.B 808 nm (0,5 W cm-2) dalga boyunda lazer radyasyonuna maruz kalan çeşitli RuDA NP konsantrasyonlarının termal görüntüleri.C Kantitatif veriler olan çeşitli cevher NP konsantrasyonlarının fototermal dönüşüm eğrileri.B. D CEVHER NP ve ICG'nin 5 ısıtma-soğutma döngüsü boyunca sıcaklık artışı.
RuDA NP'lerinin MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerine karşı fotositotoksisitesi in vitro olarak değerlendirildi.Şekilde gösterildiği gibi.6A, B, RuDA-NP'ler ve RuDA, ışınlama yokluğunda ihmal edilebilir sitotoksisite sergilediler ve bu da RuDA-NP'ler ve RuDA'nın daha düşük karanlık toksisitesi anlamına geliyordu.Bununla birlikte, 808 nm dalga boyunda lazer radyasyonuna maruz kaldıktan sonra, RuDA ve RuDA NP'leri, sırasıyla 5.4 ve 9.4 μM IC50 değerleri (yarım maksimum inhibitör konsantrasyon) ile MDA-MB-231 kanser hücrelerine karşı güçlü fotositotoksisite gösterdi. RuDA-NP ve RuDA'nın kanser fototerapisi için potansiyele sahip olduğu.Ek olarak, ROS'un ışık kaynaklı sitotoksisitedeki rolünü aydınlatmak için, bir ROS temizleyicisi olan C vitamini (Vc) varlığında RuDA-NP ve RuDA'nın fotositotoksisitesi ayrıca araştırıldı.Açıkçası, Vc ilavesinden sonra hücre canlılığı arttı ve RuDA ve RuDA NP'lerinin IC50 değerleri sırasıyla 25.7 ve 40.0 μM idi, bu da ROS'un RuDA ve RuDA NP'lerinin fotositotoksisitesindeki önemli rolünü kanıtlıyor.Kalsein AM (canlı hücreler için yeşil floresan) ve propidyum iyodür (PI, ölü hücreler için kırmızı floresan) kullanılarak canlı/ölü hücre boyama yoluyla MDA-MB-231 kanser hücrelerinde RuDA-NP'lerin ve RuDA'nın ışık kaynaklı sitotoksisitesi.hücreler tarafından onaylandı) floresan problar olarak.Şekil 6C'de gösterildiği gibi, RuDA-NP veya RuDA ile tedavi edilen hücreler, yoğun yeşil floresan ile kanıtlandığı gibi, ışınlama olmadan canlı kaldı.Aksine, lazer ışıması altında, RuDA veya RuDA NP'lerinin etkin fotositotoksisitesini doğrulayan sadece kırmızı floresan gözlendi.RuDA ve RuDA NP'lerinin fotositotoksisitesinin ihlal edildiğini gösteren Vc ilavesi üzerine yeşil flüoresansın ortaya çıkması dikkat çekicidir.Bu sonuçlar, in vitro fotositotoksisite deneyleriyle tutarlıdır.
Sırasıyla Vc (0.5 mM) varlığında veya yokluğunda MDA-MB-231 hücrelerinde A RuDA- ve B RuDA-NP hücrelerinin doza bağlı canlılığı.Hata çubukları, ortalama ± standart sapma (n = 3). Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001.C Floresan problar olarak kalsein AM ve propidyum iyodür kullanılarak canlı/ölü hücre boyama analizi.Ölçek çubuğu: 30 µm.Her gruptan üç biyolojik tekrarın temsili görüntüleri gösterilmektedir.D Farklı tedavi koşulları altında MDA-MB-231 hücrelerinde ROS üretiminin eş odaklı floresan görüntüleri.Yeşil DCF floresansı, ROS'un varlığını gösterir.0,5 W/cm2 gücünde 808 nm dalga boyuna sahip bir lazerle 10 dakika (300 J/cm2) ışınlayın.Ölçek çubuğu: 30 µm.Her gruptan üç biyolojik tekrarın temsili görüntüleri gösterilmektedir.E Akış sitometrisi 10 dakika boyunca Vc (0.5 mM) varlığında ve yokluğunda 808 nm lazer (0,5 W cm-2) ile veya lazer olmadan RuDA-NP'ler (50 uM) veya RuDA (50 uM) tedavi analizi.Her gruptan üç biyolojik tekrarın temsili görüntüleri gösterilmektedir.808 nm lazer ışıması (0,5 W cm-2, 10 dakika, 300 J cm-2) ile veya olmadan RuDA-NP'ler (50 uM) ile tedavi edilen MDA-MB-231 hücrelerinin F Nrf-2, HSP70 ve HO-1'i, hücreler 2) ifade eder.Her gruptan iki biyolojik tekrarın temsili görüntüleri gösterilmektedir.
MDA-MB-231 hücrelerinde hücre içi ROS üretimi, 2,7-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) boyama yöntemi kullanılarak incelenmiştir.Şekilde gösterildiği gibi.Şekil 6D'de gösterildiği gibi, RuDA-NP'ler veya RuDA ile tedavi edilen hücreler, 808 nm lazer ile ışınlandığında belirgin yeşil flüoresans sergiledi, bu da RuDA-NP'lerin ve RuDA'nın ROS üretme konusunda verimli bir yeteneğe sahip olduğunu gösterir.Aksine, ışığın yokluğunda veya Vc'nin varlığında, hücrelerin yalnızca hafif bir ROS oluşumunu gösteren zayıf bir floresan sinyali gözlendi.RuDA-NP hücrelerinde ve RuDA ile muamele edilmiş MDA-MB-231 hücrelerinde hücre içi ROS seviyeleri ayrıca akış sitometrisi ile belirlendi.Ek Şekil 25'te gösterildiği gibi, RuDA-NP'ler ve RuDA tarafından 808 nm lazer ışınlaması altında üretilen ortalama flüoresans yoğunluğu (MFI), kontrol grubuna kıyasla sırasıyla yaklaşık 5,1 ve 4,8 kat arttı ve mükemmel oluşum AFK'lerini doğruladı.kapasite.Bununla birlikte, RuDA ile tedavi edilen RuDA-NP veya MDA-MB-231 hücrelerindeki hücre içi ROS seviyeleri, konfokal floresan analizinin sonuçlarına benzer şekilde, yalnızca lazer ışınlaması olmayan veya Vc varlığında kontrollerle karşılaştırılabilirdi.
Mitokondrinin Ru(II)-aren komplekslerinin ana hedefi olduğu gösterilmiştir60.Bu nedenle, RuDA ve RuDA-NP'lerin hücre içi lokalizasyonu araştırıldı.Ek Şekil 26'da gösterildiği gibi, RuDA ve RuDA-NP, mitokondride en yüksek birikime sahip benzer hücresel dağılım profillerini gösterir (sırasıyla 62.5 ± 4.3 ve 60.4 ± 3.6 ng/mg protein).Bununla birlikte, Cevher ve NP Cevherinin nükleer fraksiyonlarında sadece küçük bir miktarda Ru bulundu (sırasıyla %3.5 ve %2.1).Kalan hücre fraksiyonu kalıntı rutenyum içermiştir: RuDA için %31.7 (30.6 ± 3.4 ng/mg protein) ve RuDA-NP'ler için %42.9 (47.2 ± 4.5 ng/mg protein).Genel olarak, Cevher ve NP Cevheri esas olarak mitokondride birikir.Mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmek için sırasıyla mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit üretim kapasitesini değerlendirmek için JC-1 ve MitoSOX Red boyamasını kullandık.Ek Şekil 27'de gösterildiği gibi, 808 nm lazer ışıması altında hem RuDA hem de RuDA-NP'lerle tedavi edilen hücrelerde yoğun yeşil (JC-1) ve kırmızı (MitoSOX Red) flüoresans gözlendi; bu, hem RuDA hem de RuDA-NP'lerin yüksek oranda flüoresan olduğunu gösterir. Mitokondriyal membran depolarizasyonunu ve süperoksit üretimini etkili bir şekilde indükleyebilir.Ek olarak, hücre ölümünün mekanizması, anneksin V-FITC/propidium iyodür (PI)'nin akış sitometrisine dayalı analizi kullanılarak belirlendi.Şekil 6E'de gösterildiği gibi, 808 nm lazerle ışınlandığında, RuDA ve RuDA-NP, PBS veya PBS plus lazere kıyasla MDA-MB-231 hücrelerinde önemli ölçüde artmış erken apoptoz oranı (sağ alt kadran) indükledi.işlenmiş hücrelerBununla birlikte, Vc eklendiğinde, RuDA ve RuDA-NP'nin apoptoz oranı sırasıyla %50.9 ve %52.0'dan %15.8 ve %17.8'e önemli ölçüde düşmüştür, bu da ROS'un RuDA ve RuDA-NP'nin fotositotoksisitesindeki önemli rolünü doğrulamaktadır..Ek olarak, test edilen tüm gruplarda (sol üst kadran) hafif nekrotik hücreler gözlendi, bu da apoptozun RuDA ve RuDA-NP'ler tarafından indüklenen hücre ölümünün baskın formu olabileceğini düşündürdü.
Oksidatif stres hasarı apoptozun ana belirleyicisi olduğundan, antioksidan sistemin kilit düzenleyicisi olan eritroid 2, faktör 2 (Nrf2) 62 ile ilişkili nükleer faktör RuDA-NP'lerle tedavi edilen MDA-MB-231'de araştırıldı.Işınlama ile indüklenen RuDA NP'lerinin etki mekanizması.Aynı zamanda, aşağı akış proteini heme oksijenaz 1'in (HO-1) ifadesi de tespit edildi.Şekil 6F ve Ek Şekil 29'da gösterildiği gibi, RuDA-NP aracılı fototerapi, PBS grubuna kıyasla Nrf2 ve HO-1 ekspresyon seviyelerini arttırdı, bu da RuDA-NP'lerin oksidatif stres sinyal yollarını uyarabileceğini gösterir.Ek olarak, RuDA-NPs63'ün fototermal etkisini incelemek için ısı şoku proteini Hsp70'in ifadesi de değerlendirildi.RuDA-NP'ler + 808 nm lazer ışıması ile tedavi edilen hücrelerin, diğer iki grupla karşılaştırıldığında, hipertermiye hücresel bir tepkiyi yansıtan Hsp70 ekspresyonunda artış gösterdiği açıktır.
Olağanüstü in vitro sonuçlar, MDA-MB-231 tümörlü çıplak farelerde RuDA-NP'nin in vivo performansını araştırmamıza neden oldu.RuDA NP'lerinin doku dağılımı, karaciğer, kalp, dalak, böbrekler, akciğerler ve tümörlerdeki rutenyum içeriği belirlenerek incelenmiştir.Şekilde gösterildiği gibi.Şekil 7A'da gösterildiği gibi, normal organlardaki maksimum Cevher NP içeriği ilk gözlem zamanında (4 saat) ortaya çıkarken, maksimum içerik muhtemelen Cevher NP'lerinden dolayı enjeksiyondan 8 saat sonra tümör dokularında belirlendi.LF'nin EPR etkisi.Dağılım sonuçlarına göre, NP cevheri ile optimal tedavi süresi uygulamadan 8 saat sonra alınmıştır.RuDA-NP'lerin tümör bölgelerinde birikim sürecini göstermek için, RuDA-NP'lerin fotoakustik (PA) özellikleri, enjeksiyondan sonra farklı zamanlarda RuDA-NP'lerin PA sinyalleri kaydedilerek izlendi.İlk olarak, in vivo olarak RuDA-NP'nin PA sinyali, RuDA-NP'nin intratumoral enjeksiyonundan sonra bir tümör bölgesinin PA görüntüleri kaydedilerek değerlendirildi.Ek Şekil 30'da gösterildiği gibi, RuDA-NP'ler güçlü bir PA sinyali gösterdi ve RuDA-NP konsantrasyonu ile PA sinyal yoğunluğu arasında pozitif bir korelasyon vardı (Ek Şekil 30A).Daha sonra, enjeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında RuDA ve RuDA-NP'nin intravenöz enjeksiyonundan sonra tümör bölgelerinin in vivo PA görüntüleri kaydedildi.Şekil 7B'de gösterildiği gibi, tümör bölgesinden gelen RuDA-NP'lerin PA sinyali zamanla kademeli olarak arttı ve enjeksiyondan 8 saat sonra, ICP-MS analizi ile belirlenen doku dağılımı sonuçlarıyla tutarlı olarak bir platoya ulaştı.RuDA ile ilgili olarak (Ek Şekil 30B), maksimum PA sinyal yoğunluğu, enjeksiyondan 4 saat sonra ortaya çıktı ve bu, RuDA'nın tümöre hızlı bir giriş oranını gösterir.Ayrıca, ICP-MS kullanılarak idrar ve dışkıdaki rutenyum miktarı belirlenerek RuDA ve RuDA-NP'lerin boşaltım davranışı araştırıldı.RuDA (Ek Şekil 31) ve RuDA-NP'ler (Şekil 7C) için ana eliminasyon yolu dışkı yoluyladır ve 8 günlük çalışma süresi boyunca RuDA ve RuDA-NP'lerin etkin bir şekilde temizlenmesi gözlemlenmiştir, bu da RuDA anlamına gelir. ve RuDA-NP'ler, uzun süreli toksisite olmaksızın vücuttan etkin bir şekilde elimine edilebilir.
A. RuDA-NP'nin fare dokularında ex vivo dağılımı, enjeksiyondan sonra farklı zamanlarda Ru içeriği (doku gramı başına uygulanan Ru dozunun (ID) yüzdesi) ile belirlendi.Veriler ortalama ± standart sapmadır (n = 3). Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001.RuDA-NP'lerin (10 µmol kg-1) farklı zaman noktalarında intravenöz uygulamasından sonra 808 nm eksitasyonda in vivo tümör bölgelerinin B PA görüntüleri.RuDA NP'lerinin (10 umol kg-1) intravenöz uygulamasından sonra, C Ru farelerden farklı zaman aralıklarında idrar ve feçes ile atılmıştır.Veriler ortalama ± standart sapmadır (n = 3).
RuDA-NP'nin in vivo ısıtma kapasitesi, karşılaştırma için MDA-MB-231 ve RuDA tümörlü çıplak farelerde incelenmiştir.Şekilde gösterildiği gibi.8A ve ek Şekil 32'de, kontrol (tuzlu su) grubu, 10 dakikalık sürekli maruziyetten sonra daha az sıcaklık değişimi (ΔT ≈ 3 °C) gösterdi.Bununla birlikte, RuDA-NP'lerin ve RuDA'nın sıcaklığı, sırasıyla 55.2 ve 49.9 °C'lik maksimum sıcaklıklarla hızla arttı ve in vivo kanser tedavisi için yeterli hipertermi sağladı.RuDA NP'leri için (ΔT ≈ 24°C) RuDA'ya (ΔT ≈ 19°C) kıyasla yüksek sıcaklıkta gözlenen artış, EPR etkisine bağlı olarak tümör dokularında daha iyi geçirgenliği ve birikimi nedeniyle olabilir.
Enjeksiyondan 8 saat sonra farklı zamanlarda 808 nm lazerle ışınlanmış MDA-MB-231 tümörlü farelerin kızılötesi termal görüntüleri.Her gruptan dört biyolojik tekrarın temsili görüntüleri gösterilmektedir.B Bağıl tümör hacmi ve C Tedavi sırasında farklı fare gruplarının ortalama tümör kütlesi.D Farklı fare gruplarının vücut ağırlıklarının eğrileri.0,5 W/cm2 gücünde 808 nm dalga boyuna sahip bir lazerle 10 dakika (300 J/cm2) ışınlayın.Hata çubukları, ortalama ± standart sapma (n = 3). Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Eşleştirilmemiş, iki taraflı t testleri *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ve ***p <0,001. Eşlenmemiş iki kuyruklu t testleri *p<0,05, **p<0,01 ve ***p<0,001. Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP'ler ve RuDA-NPs + Laser grupları dahil olmak üzere farklı tedavi gruplarından ana organ ve tümörlerin E H&E boyama görüntüleri. Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP'ler ve RuDA-NPs + Laser grupları dahil olmak üzere farklı tedavi gruplarından ana organ ve tümörlerin E H&E boyama görüntüleri. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Salin, salin + lazer, RuDA, RuDA + Lazer, RuDA-NP'ler ve RuDA-NP'ler + Lazer grupları dahil olmak üzere farklı tedavi gruplarından büyük organların ve tümörlerin E H&E boyama görüntüleri.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光、RuDA-NP'ler 和RuDA-NP'ler + 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Salin, salin + lazer, RuDA, RuDA + lazer, RuDA-NP'ler ve RuDA-NP'ler + lazer dahil olmak üzere çeşitli tedavi gruplarından majör organların ve tümörlerin E H&E boyaması.Ölçek çubuğu: 60 µm.
RuDA ve RuDA NP'leri ile in vivo fototerapinin etkisi, MDA-MB-231 tümörlü çıplak farelere kuyruk damarı yoluyla 10.0 µmol kg-1'lik tek bir dozda RuDA veya RuDA NP'lerin intravenöz olarak enjekte edildiği ve daha sonra 8 Enjeksiyondan saatler sonra.808 nm dalga boyunda lazer ışınlaması.Şekil 8B'de gösterildiği gibi, salin ve lazer gruplarında tümör hacimleri önemli ölçüde arttı, bu da salin veya lazer 808 ışınlamasının tümör büyümesi üzerinde çok az etkisi olduğunu gösteriyor.Tuzlu grupta olduğu gibi, lazer ışınlaması olmadan RuDA-NP'ler veya RuDA ile tedavi edilen farelerde de hızlı tümör büyümesi gözlendi ve düşük karanlık toksisitelerini gösterdi.Buna karşılık, lazer ışınlamasından sonra, hem RuDA-NP hem de RuDA tedavisi, salinle tedavi edilen gruba kıyasla sırasıyla %95.2 ve %84.3'lük tümör hacmi azalmalarıyla önemli tümör regresyonu indükledi ve bu da mükemmel sinerjistik PDT'yi gösterdi., RuDA/CHTV etkisinin aracılık ettiği.– NP veya Cevher RuDA ile karşılaştırıldığında, RuDA NP'leri, esas olarak RuDA NP'lerinin EPR etkisinden kaynaklanan daha iyi bir fototerapötik etki gösterdi.Tümör büyümesinin inhibisyonu sonuçları, tedavinin 15. gününde eksize edilen tümör ağırlığı ile ayrıca değerlendirildi (Şekil 8C ve Ek Şekil 33).RuDA-NP ile tedavi edilen farelerde ve RuDA ile tedavi edilen farelerde ortalama tümör kütlesi sırasıyla 0.08 ve 0.27 g idi ve bu, kontrol grubundan (1.43 g) çok daha hafifti.
Ek olarak, RuDA-NP'lerin veya RuDA'nın in vivo karanlık toksisitesini incelemek için her üç günde bir farelerin vücut ağırlığı kaydedildi.Şekil 8D'de gösterildiği gibi, tüm tedavi grupları için vücut ağırlığında önemli farklılıklar gözlenmedi. Ayrıca, farklı tedavi gruplarından ana organların (kalp, karaciğer, dalak, akciğer ve böbrek) hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yapıldı. Ayrıca, farklı tedavi gruplarından majör organların (kalp, karaciğer, dalak, akciğer ve böbrek) hematoksilen ve eozin (H&E) boyamaları yapıldı. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердселеца, печипниз, Ayrıca farklı tedavi gruplarından majör organların (kalp, karaciğer, dalak, akciğerler ve böbrekler) hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yapıldı.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (O) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печечени, снпел, Ayrıca farklı tedavi gruplarında majör organların (kalp, karaciğer, dalak, akciğer ve böbrek) hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yapıldı.Şekilde gösterildiği gibi.Şekil 8E'de, RuDA-NP'lerden ve RuDA gruplarından beş ana organın H&E boyama görüntüleri, belirgin bir anormallik veya organ hasarı göstermez. Şekil 8E'de, RuDA-NP'lerden ve RuDA gruplarından beş ana organın H&E boyama görüntüleri, belirgin bir anormallik veya organ hasarı göstermez.Şekilde gösterildiği gibi.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NP'ler ve RuDA не демонстрируют явныех аномалпий оружия. 8E, RuDA-NP'ler ve RuDA gruplarından beş ana organın H&E boyama görüntüleri, belirgin organ anormallikleri veya lezyonları göstermez.如图8E 所示，来自RuDA-NP'ler 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损伤。如图8E 所示，来自RuDA-NP'ler 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 8E'nin en büyük ve en çok okunan 8E, H&E ile ilgili olan H&E ile ilgili olan RuDA-NP'ler ve RuDA-NP'ler ile ilgili. Şekil 8E'de gösterildiği gibi, RuDA-NP'ler ve RuDA gruplarından beş ana organın H&E boyama görüntüleri, belirgin bir anormallik veya organ hasarı göstermedi.Bu sonuçlar, ne RuDA-NP ne de RuDA'nın in vivo toksisite belirtileri göstermediğini gösterdi. Ayrıca, tümörlerin H&E boyama görüntüleri, hem RuDA + Laser hem de RuDA-NPs + Laser gruplarının ciddi kanser hücresi yıkımına neden olabileceğini gösterdi ve RuDA ve RuDA-NP'lerin mükemmel in vivo fototerapötik etkinliğini gösterdi. Ayrıca, tümörlerin H&E boyama görüntüleri, hem RuDA + Laser hem de RuDA-NPs + Laser gruplarının ciddi kanser hücresi yıkımına neden olabileceğini gösterdi ve RuDA ve RuDA-NP'lerin mükemmel in vivo fototerapötik etkinliğini gösterdi.Ek olarak, hematoksilen-eozin ile boyanmış tümör görüntüleri, hem RuDA+Lazer hem de RuDA-NPs+Lazer gruplarının kanser hücrelerinde ciddi yıkımı indükleyebildiğini göstererek, RuDA ve RuDA-NP'lerin in vivo üstün fototerapötik etkinliğini ortaya koydu.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Lazer 和RuDA-NP'ler + Lazer 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NP'ler 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 ， ， ruda + lazer 和 ruda-nps + lazer 组均 导致 的 癌细胞 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗。。。。。。。。。。。。。 。。。Ek olarak, hematoksilen ve eozinle boyanmış tümör görüntüleri, hem RuDA+Lazer hem de RuDA-NPs+Lazer gruplarının kanser hücrelerinde ciddi yıkıma yol açtığını ve RuDA ve RuDA-NP'lerin in vivo üstün fototerapötik etkinliğini ortaya koyduğunu göstermiştir.
Sonuç olarak, DA tipi ligandlara sahip Ru(II)-aren (RuDA) organometalik kompleksi, toplama yöntemi kullanılarak ISC sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.Sentezlenen RuDA, RuDA'dan türetilen supramoleküler sistemler oluşturmak için kovalent olmayan etkileşimler yoluyla kendi kendine bir araya gelebilir, böylece ışık kaynaklı kanser tedavisi için 1O2 oluşumunu ve verimli fototermal dönüşümü kolaylaştırır.Monomerik RuDA'nın 808 nm'de lazer ışıması altında 1O2 üretmemesi, ancak kümelenmiş halde büyük miktarda 1O2 üretebilmesi, tasarımımızın rasyonelliğini ve verimliliğini göstermesi dikkat çekicidir.Sonraki çalışmalar, supramoleküler düzeneğin, PDT ve PTT işleme için oldukça arzu edilen kırmızıya kayma absorpsiyonu ve fotoağartma direnci gibi gelişmiş fotofiziksel ve fotokimyasal özelliklerle RuDA'yı donattığını göstermiştir.Hem in vitro hem de in vivo deneyler, iyi biyouyumluluk ve tümörde iyi birikime sahip RuDA NP'lerinin, 808 nm dalga boyunda lazer ışınlaması üzerine mükemmel ışık kaynaklı antikanser aktivitesi sergilediğini göstermiştir.Bu nedenle, etkili bimodal supramoleküler PDT/PTW reaktifleri olarak RuDA NP'leri, 800 nm'nin üzerindeki dalga boylarında aktive edilen ışığa duyarlılaştırıcılar setini zenginleştirecektir.Supramoleküler sistemin kavramsal tasarımı, mükemmel ışığa duyarlılaştırma etkileri olan NIR ile aktive olan ışığa duyarlılaştırıcılar için verimli bir yol sağlar.
Tüm kimyasallar ve çözücüler ticari tedarikçilerden temin edilmiş ve daha fazla saflaştırılmadan kullanılmıştır.RuCl3, Boren Precious Metals Co., Ltd.'den (Kunming, Çin) satın alındı.[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) ve 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol önceki çalışmalara göre sentezlendi64,65.NMR spektrumları, solvent olarak d6-DMSO veya CDCl3 kullanılarak Southeastern Üniversitesi Analitik Test Merkezinde bir Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrometre üzerinde kaydedildi.Kimyasal kaymalar δ ppm olarak verilmiştir.tetrametilsilan ile ilgili olarak ve etkileşim sabitleri J, hertz cinsinden mutlak değerler olarak verilir.Agilent 6224 ESI/TOF MS cihazında yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) gerçekleştirilmiştir.C, H ve N'nin element analizi, bir Vario MICROCHNOS element analizi cihazında (Elementar) yapıldı.UV-görünür spektrumlar, bir Shimadzu UV3600 spektrofotometre üzerinde ölçülmüştür.Floresans spektrumları, bir Shimadzu RF-6000 spektroflorimetresi üzerinde kaydedildi.EPR spektrumları, bir Bruker EMXmicro-6/1 cihazına kaydedildi.Hazırlanan numunelerin morfolojisi ve yapısı, 200 kV gerilimde çalışan FEI Tecnai G20 (TEM) ve Bruker Icon (AFM) cihazlarında incelenmiştir.Dinamik ışık saçılımı (DLS), bir Nanobrook Omni analizöründe (Brookhaven) gerçekleştirilmiştir.Fotoelektrokimyasal özellikler, bir elektrokimyasal düzenekte (CHI-660, Çin) ölçüldü.Fotoakustik görüntüler FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR sistemi kullanılarak elde edildi.Bir Olympus FV3000 konfokal mikroskobu kullanılarak eş odaklı görüntüler elde edildi.FACS analizi, bir BD Calibur akış sitometresinde gerçekleştirilmiştir.Bir 2489 UV/Vis detektörü kullanılarak bir Waters Alliance e2695 sistemi üzerinde yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) deneyleri yapıldı.Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) testleri, bir ERC RefratoMax520 kırılma indisi dedektörü kullanılarak bir Thermo ULTIMATE 3000 cihazına kaydedildi.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481.0 mg, 1.0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652.0 mg, 1.0 mmol) ve buzlu asetik asit (30 mL) geri akış buzdolabında 12 saat karıştırıldı.Çözücü daha sonra bir döner buharlaştırıcı kullanılarak vakumla çıkarıldı.Nihai tortu, yeşil bir toz halinde RuDA'yı (verim: 877.5 mg, %80) elde etmek için flaş kolon kromatografisiyle (silis jel, CH2Cl2:MeOH=20:1) arıtıldı.anüs.C64H48Cl2N8RuS için hesaplanmıştır: C 67.84, H 4.27, N 9.89.Bulunan: C 67.92, H 4.26, N 9.82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 8 10.04 (s, 2H), 8.98 (s, 2H), 8.15 (s, 2H), 7.79 (s, 4H), 7.44 (s, 8H), 7.21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.103.49, 12049.81, 124.49. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097.25.
4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolün (L2) sentezi: L2 iki aşamada sentezlendi.N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilin (1.05 g, 2.4 mmol) ve 4,7-dibromo-5,6-dinitro solüsyonu - 2'ye Pd(PPh3)4 (46 mg, 0.040 mmol) eklendi, 1,3-benzotiadiazol (0.38 g, 1.0 mmol) kuru toluen (100 mi) içinde.Karışım, 100°C'de 24 saat karıştırıldı.Toluenin vakumla çıkarılmasından sonra elde edilen katı, petrol eteri ile yıkandı.Daha sonra bu bileşiğin (234.0 mg, 0.45 mmol) ve demir tozunun (0.30 g, 5.4 mmol) asetik asit (20 mi) içindeki bir karışımı 80°C'de 4 saat karıştırıldı.Reaksiyon karışımı, su içine döküldü ve nihai kahverengi katı, süzülerek toplandı.Ürün, yeşil bir katı (126.2 mg, %57 verim) verecek şekilde vakum süblimleştirme ile iki kez saflaştırıldı.anüs.C26H32N6S için hesaplanmıştır: C 67.79, H 7.00, N 18.24.Bulunan: C 67.84, H 6.95, H 18.16.1H NMR (600 MHz, CDCI3), 8 (ppm) 7.42 (d, 4H), 6.84 (d, 4H), 4.09 (s, 4H), 3.42 (d, 8H), 1.22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDCI3), 8 (ppm) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461.24.
Bileşikler, RuDA'ya benzer prosedürler izlenerek hazırlandı ve saflaştırıldı.anüs.C48H48Cl2N8RuS için hesaplanmıştır: C 61.27, H 5.14, N 11.91.Bulunan: C, 61.32, H, 5.12, N, 11.81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 8 (ppm) 10.19 (s, 2H), 9.28 (s, 2H), 8.09 (s, 2H), 7.95 (s, 4H), 6.93 (s, 4H), 6.48 (d, 2H), 6.34 (s, 2H), 3.54 (t, 8H), 2.80 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.31 (t, 12H), 1.07 (s, 6H).13c nmr (151 mhz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0, 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905.24.
RuDA, 10 uM'lik bir konsantrasyonda MeOH/H2O (5/95, v/v) içinde çözüldü.RuDA'nın absorpsiyon spektrumu, 808 nm (0,5 W/cm2) dalga boyuna sahip lazer ışığı ile ışınlama altında bir Shimadzu UV-3600 spektrofotometre üzerinde her 5 dakikada bir ölçülmüştür.ICG spektrumları, standartla aynı koşullar altında kaydedildi.
EPR spektrumları, 20 mW mikrodalga gücüne, 100 G tarama aralığına ve 1 G alan modülasyonuna sahip bir Bruker EMXmicro-6/1 spektrometresine kaydedildi. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidon (TEMP) ve 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksit (DMPO) döndürme tuzakları olarak kullanıldı.Elektron spin rezonans spektrumları, 808 nm (0,5 W/cm2) dalga boyuna sahip lazer radyasyonunun etkisi altında RuDA (50 uM) ve TEMF (20 mM) veya DMPO (20 mM) karma çözeltileri için kaydedildi.
RuDA için DFT ve TD-DFT hesaplamaları, Gauss programı 1666,67,68 kullanılarak sulu çözelti içinde PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ seviyelerinde gerçekleştirilmiştir.Düşük enerjili singlet uyarılmış durum RuDA'nın HOMO-LUMO, delik ve elektron dağılımları GaussView programı (versiyon 5.0) kullanılarak çizildi.
İlk önce standart olarak ICG (ΦΔ = 0.002) ile geleneksel UV-görünür spektroskopi kullanarak 1O2 RuDA'nın üretim verimliliğini ölçmeye çalıştık, ancak ICG'nin fotodegradasyonu sonuçları güçlü bir şekilde etkiledi.Böylece, 1O2 RuDA'nın kuantum verimi, dalga boyu 808 nm (0,5 W/cm2) olan bir lazerle ışınlandığında yaklaşık 428 nm'de ABDA floresansının yoğunluğunda bir değişiklik saptanarak ölçülmüştür.ABDA (50 uM) içeren su/DMF (98/2, v/v) içindeki RuDA ve RuDA NP'leri (20 uM) üzerinde deneyler yapıldı.1O2'nin kuantum verimi, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS ve rICG sırasıyla ABDA'nın ışığa duyarlılaştırıcıdan ve ICG'den elde edilen 1O2 ile reaksiyon hızlarıdır.APS ve AICG, sırasıyla 808 nm'de ışığa duyarlılaştırıcı ve ICG'nin absorbansıdır.
AFM ölçümleri, bir Bruker Dimension Icon AFM sisteminde tarama modu kullanılarak sıvı koşullarda gerçekleştirilmiştir.Sıvı hücrelerle açık bir yapı kullanılarak hücreler iki kez etanol ile yıkandı ve bir nitrojen akımı ile kurutuldu.Kurutulmuş hücreleri mikroskobun optik kafasına yerleştirin.Numunenin bir damlasını hemen sıvı havuzuna koyun ve steril tek kullanımlık plastik bir şırınga ve steril bir iğne kullanarak konsolun üzerine yerleştirin.Başka bir damla doğrudan numunenin üzerine yerleştirilir ve optik başlık indirildiğinde, iki damla birleşerek numune ile sıvı rezervuarı arasında bir menisküs oluşturur.AFM ölçümleri, bir SCANASYST-FLUID V-şekilli nitrür konsol (Bruker, sertlik k = 0.7 N m-1, f0 = 120-180 kHz) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
HPLC kromatogramları, bir 2489 UV/Vis detektörü kullanılarak bir phoenix C18 kolonu (250 x 4.6 mm, 5 um) ile donatılmış bir Waters e2695 sistemi üzerinde elde edildi.Dedektörün dalga boyu 650 nm'dir.Mobil fazlar A ve B sırasıyla su ve metanol idi ve mobil faz akış hızı 1.0 ml.dk-1 idi.Gradyan (çözücü B) aşağıdaki gibidir: 0 ila 4 dakika arasında %100, 5 ila 30 dakika arasında %100 ila %50 ve 31 ila 40 dakika arasında %100'e sıfırlama.Cevher, 50 uM'lik bir konsantrasyonda metanol ve sudan (hacimce 50/50) oluşan karışık bir çözelti içinde çözüldü.Enjeksiyon hacmi 20 ul idi.
GPC tahlilleri, iki PL aquagel-OH MIXED-H kolonu (2x300x7.5 mm, 8 um) ve bir ERC RefratoMax520 kırılma indeksi dedektörü ile donatılmış bir Thermo ULTIMATE 3000 cihazına kaydedildi.GPC kolonu, 30°C'de 1 ml/dakikalık bir akış hızında su ile ayrıştırılmıştır.Cevher NP'leri, PBS çözeltisi (pH = 7.4, 50 uM) içinde çözüldü, enjeksiyon hacmi 20 uL idi.
Fotoakımlar bir elektrokimyasal düzende (CHI-660B, Çin) ölçüldü.Lazer açılıp kapatıldığında (808 nm, 0,5 W/cm2) optoelektronik tepkiler, sırasıyla bir kara kutuda 0,5 V'luk bir voltajda ölçülmüştür.Çalışma elektrotu olarak L şeklinde camsı karbon elektrot (GCE), referans elektrot olarak standart kalomel elektrot (SCE) ve karşı elektrot olarak platin disk ile standart bir üç elektrotlu hücre kullanıldı.Elektrolit olarak 0.1 M Na2SO4 çözeltisi kullanıldı.
İnsan meme kanseri hücre dizisi MDA-MB-231, KeyGEN Biotec Co., LTD'den (Nanjing, Çin, katalog numarası: KG033) satın alındı.Hücreler, %10 fetal bovin serumu (FBS), penisilin (100 ug/ml) ve streptomisin (100 ug/ml) ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle's Medium'da (DMEM, yüksek glukoz) tek tabakalar halinde büyütüldü.Tüm hücreler, %5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37°C'de kültürlendi.
MTT tahlili, Vc (0.5 mM) olsun veya olmasın, ışık ışıması varlığında ve yokluğunda RuDA ve RuDA-NP'lerin sitotoksisitesini belirlemek için kullanıldı.MDA-MB-231 kanser hücreleri, yaklaşık 1 x 105 hücre/ml/kuyucuk hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalarda büyütüldü ve %5 CO2 ve %95 hava atmosferinde 37.0°C'de 12 saat inkübe edildi.Suda çözünen RuDA ve RuDA NP'ler hücrelere eklendi.12 saatlik inkübasyondan sonra hücreler, 10 dakika boyunca (300 J cm-2) 808 nm dalga boyunda 0.5 W cm -2 lazer radyasyonuna maruz bırakıldı ve daha sonra 24 saat boyunca karanlıkta inkübe edildi.Hücreler daha sonra 5 saat daha MTT (5 mg/ml) ile inkübe edildi.Son olarak, ortaya çıkan mor formazan kristallerini çözmek için ortamı DMSO'ya (200 µl) değiştirin.OD değerleri, 570/630 nm dalga boyuna sahip bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür.Her numune için IC50 değeri, en az üç bağımsız deneyden elde edilen doz-yanıt eğrilerinden SPSS yazılımı kullanılarak hesaplandı.
MDA-MB-231 hücreleri, 50 uM konsantrasyonda RuDA ve RuDA-NP ile işlendi.12 saatlik inkübasyondan sonra hücreler, 808 nm dalga boyunda ve 0,5 W/cm2 gücünde bir lazerle 10 dakika (300 J/cm2) ışınlandı.C vitamini (Vc) grubunda, hücreler lazer ışınlamasından önce 0,5 mM Vc ile tedavi edildi.Hücreler daha sonra 24 saat daha karanlıkta inkübe edildi, daha sonra kalsein AM ve propidyum iyodür (20 ug/ml, 5 ul) ile 30 dakika boyandı, sonra PBS (10 ul, pH 7.4) ile yıkandı.lekeli hücrelerin görüntüleri.