Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, desteğin devam etmesini sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Aktifleştirilmiş esterlere veya fenoksi radikallerine dayalı enzimatik yakınlık etiketleme yöntemleri, canlı hücrelerde hücre altı proteomları ve protein etkileşimlerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır.Bununla birlikte, aktifleştirilmiş esterler daha az reaktiftir, bu da geniş bir etiketleme yarıçapına neden olur ve peroksit muamelesi tarafından üretilen fenoksi radikalleri redoks yollarına müdahale edebilir.Burada miniSOG ışığa duyarlılaştırıcı proteini ilgili bir proteine genetik olarak bağlayarak geliştirilen bir yakınlık etiketlemeye bağlı fotoaktivasyon (PDPL) yöntemini rapor ediyoruz.Mavi ışıkla tetiklenen ve maruz kalma süresiyle kontrol edilen tekli oksijen üretilir ve daha sonra histidin kalıntılarının anilin probu tarafından uzaysal-zamansal olarak çözülmüş etiketlenmesi sağlanır.Organele özgü proteom haritalama yoluyla yüksek sadakatini gösteriyoruz.PDPL ile TurboID'nin yan yana karşılaştırılması, PDPL'nin daha spesifik ve kapsamlı bir proteomik kapsamını gösterir.Daha sonra, hastalıkla ilişkili transkripsiyonel koaktivatör BRD4 ve E3 Parkin ligazına PDPL uyguladık ve daha önce bilinmeyen etkileşimciler bulduk.Aşırı ekspresyon taramasıyla, bozulmasına ubiquitination-proteasome yolunun aracılık ettiği Parkin için iki bilinmeyen substrat, Ssu72 ve SNW1 tanımlandı.
Protein ağlarının doğru karakterizasyonu birçok temel hücresel sürecin temelini oluşturur.Bu nedenle, protein etkileşimlerinin son derece doğru uzaysal-zamansal haritalaması, biyolojik yolların, hastalık patolojisinin deşifre edilmesi ve bu etkileşimlerin terapötik amaçlarla bozulması için moleküler bir temel sağlayacaktır.Bu amaçla, canlı hücrelerde veya dokularda zamansal etkileşimleri tespit edebilen yöntemler oldukça arzu edilir.Afinite Saflaştırma Kütle Spektrometrisi (AP-MS) tarihsel olarak ilgili proteinlerin (POI'ler) bağlayıcı ortaklarını belirlemek için kullanılmıştır.Kantitatif proteomik yöntemlerin geliştirilmesiyle, AP-MS'ye dayalı en büyük protein ağları veritabanı olan Bioplex3.0 oluşturuldu.AP-MS çok güçlü olmasına rağmen, iş akışındaki hücre lizizi ve seyreltme adımları, zayıf ve geçici bağlanma etkileşimlerine karşı önyargılıdır ve lizizden önce bölümlendirmeye sahip olmayan sahte etkileşim çiftleri gibi liziz sonrası eserler ortaya çıkarır.
Bu sorunları ele almak için çapraz bağlama grupları ve enzimatik yakın etiketleme (PL) platformları (örneğin APEX ve BioID)5 ile doğal olmayan amino asitler (UAA) geliştirilmiştir.UAA yöntemi birçok senaryoda başarıyla uygulanmış ve doğrudan protein yapıştırıcıları hakkında bilgi sağlasa da, UAA yerleştirme bölgesinin optimizasyonu hala gereklidir.Daha da önemlisi, etiketleme olaylarının katalitik olarak tersine çevrilmesine sahip olmayan stokiyometrik bir etiketleme yöntemidir.Buna karşılık, BioID yöntemi gibi enzimatik PL yöntemleri, tasarlanmış biyotin ligazını POI7'ye kaynaştırır, bu da daha sonra reaktif bir biyotinil-AMP ester ara maddesi oluşturmak üzere biyotini aktive eder.Böylece enzim, proksimal lizin kalıntılarını etiketleyen aktifleştirilmiş bir biyotin "bulutunu" katalize eder ve serbest bırakır.Bununla birlikte, BioID'nin, geçici çözünürlükle kullanımını engelleyen yeterli bir etiketli sinyal elde etmesi için 12 saatten fazla zamana ihtiyacı vardır.Maya gösterimine dayalı yönlendirilmiş evrimi kullanan TurboID, BioID'ye dayalı olarak daha verimli olacak şekilde tasarlandı, biotin ile 10 dakika içinde verimli etiketlemeye izin vererek daha dinamik süreçlerin çalışılmasına izin verdi.TurboID son derece aktif olduğundan ve düşük seviyeli etiketleme için endojen biyotin seviyeleri yeterli olduğundan, eksojen biyotin ilavesiyle yüksek oranda geliştirilmiş ve zamanlanmış etiketleme gerektiğinde arka plan etiketleme potansiyel bir sorun haline gelir.Ek olarak, aktifleştirilmiş esterler, özellikle komşu proteinlerin biyotin 5 ile doygunluğundan sonra geniş bir etiketleme yarıçapına yol açabilen zayıf reaktiftir (t1/2 ~5 dakika). fenol radikallerini yok eder ve bir dakika içinde protein etiketlemesine izin verir9,10.APEX, hücre altı proteomları, membran protein komplekslerini ve sitozolik sinyal protein komplekslerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır11,12.Ancak, yüksek konsantrasyonlarda peroksit ihtiyacı redoks proteinlerini veya yollarını etkileyerek hücresel süreçler.
Bu nedenle, hücresel yolları önemli ölçüde bozmadan yüksek uzaysal ve zamansal doğrulukla daha reaktif etiketli yarıçap bastırma türleri üretebilen yeni bir yöntem, mevcut yöntemlere önemli bir katkı olacaktır. Reaktif türler arasında singlet oksijen, kısa ömrü ve sınırlı difüzyon yarıçapı (hücrelerde t1/2 < 0.6 µs)13 nedeniyle dikkatimizi çekmiştir. Reaktif türler arasında singlet oksijen, kısa ömrü ve sınırlı difüzyon yarıçapı (hücrelerde t1/2 < 0.6 µs)13 nedeniyle dikkatimizi çekmiştir. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого вреомени жаризним из-за его короткого вреомени жизним из-за его короткого вреомени жизним и Aktif formlar arasında singlet oksijen kısa ömrü ve sınırlı difüzyon yarıçapı (hücrelerde t1/2 < 0.6 µs)13 nedeniyle dikkatimizi çekmiştir.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени сакого времени сачизнир). Aktif formlar arasında singlet oksijen, kısa ömrü ve sınırlı difüzyon yarıçapı (hücrelerde t1/2 < 0.6 μs) nedeniyle dikkatimizi çeker.Singlet oksijenin metionin, tirozin, histidin ve triptofanı rastgele oksitlediği ve amin veya tiyol bazlı problara 16,17 bağlanması için polar 14,15 yaptığı rapor edilmiştir.Hücre altı kompartman RNA'sını etiketlemek için tekli oksijen kullanılmış olmasına rağmen, endojen POI yakınlık belirteçlerini yeniden kullanmak için stratejiler henüz keşfedilmemiştir.Burada, bir miniSOG ışığa duyarlılaştırıcı ile kaynaşmış POI'leri aydınlatmak için mavi ışık kullandığımız ve proksimal kalıntıları oksitlemek için tekli oksijen oluşumunu tetiklediğimiz ve ardından kimyasal probları oksitlemek için amin içeren modifikasyonların izlediği, fotoaktivasyona bağlı yakınlık etiketleme (PDPL) adlı bir platform sunuyoruz. ara canlı hücreler..Etiket özgüllüğünü en üst düzeye çıkarmak için bir grup kimyasal sondayı test ettik ve açık bir proteomik iş akışı kullanarak değişiklik alanlarını belirledik.PDPL ile TurboID'nin yan yana karşılaştırılması, PDPL'nin daha spesifik ve kapsamlı bir proteomik kapsamını gösterir.Bu yaklaşımı, hem bilinen hem de bilinmeyen bir protein ağını doğrulayan kanserle ilişkili epigenetik düzenleyici protein BRD4 ve Parkinson hastalığıyla ilişkili E3 ligaz Parkin için hücre altı proteomun organel spesifik belirteçlerine ve bağlayıcı ortakların genel proteom tanımlamasına uyguladık. etkileşimler..PDPL'nin büyük protein komplekslerinde E3 substratlarını tanıma yeteneği, dolaylı bağlayıcıların tanınmasının gerekli olduğu bir durumu temsil eder.Ubiquitination-proteazomun aracılık ettiği iki bilinmeyen parkin substratı in situ doğrulanmıştır.
Fotosensitizörlerle ışık ışınlamasının tekli oksijen ürettiği fotodinamik terapi (PDT)19 ve kromofor destekli lazer inaktivasyonu (CALI)20, hedef proteinleri inaktive edebilir veya hücre ölümüne neden olabilir.Singlet oksijen, teorik difüzyon mesafesi yaklaşık 70 nm olan oldukça reaktif bir madde olduğundan, ışığa duyarlılaştırıcının etrafındaki uzamsal olarak sınırlı oksidasyon kontrol edilebilir.Bu konsepte dayanarak, canlı hücrelerde protein komplekslerinin yakın etiketlenmesini sağlamak için singlet oksijen kullanmaya karar verdik.Dört işlevi yerine getirmek için bir PDPL kemoproteomik yaklaşımı geliştirdik: (1) PL enzimatik yaklaşımına benzer şekilde aktif singlet oksijen oluşumunu katalize etmek;(2) ışığın başlaması üzerine zamana bağlı etiketleme sağlamak;(3) değişiklik yaparak (4) Arka planı azaltmak için endojen kofaktörleri (biyotin gibi) kullanmaktan kaçının veya çevresel strese hücre maruziyetini en aza indirmek için oldukça rahatsız edici eksojen reaktifler (peroksitler gibi) kullanın.
Işığa duyarlılaştırıcılar, küçük moleküler ağırlıklı floroforlar (örn. gül bengal, metilen mavisi)22 ve genetik olarak kodlanmış küçük proteinler (örn. miniSOG, KillerRed)23 olmak üzere iki kategoriye ayrılabilir.Modüler bir tasarım elde etmek için, POI24,25'e ışığa duyarlılaştırıcı (PS) proteinleri ekleyerek ilk nesil PDPL platformunu geliştirdik (Şekil 1a).Mavi ışıkla ışınlandığında, tekli oksijen proksimal nükleofilik amino asit kalıntılarını oksitler ve elektrofilik olan ve ayrıca amin prob nükleofilleri ile reaksiyona girebilen bir umpolung polaritesi ile sonuçlanır16,17.Prob, tıklama kimyasına izin vermek ve LC/MS/MS karakterizasyonu için aşağı çekmek için bir alkin tutacağı ile tasarlanmıştır.
miniSOG'un aracılık ettiği protein komplekslerinin etiketlenmesinin şematik gösterimi.Mavi ışığa maruz kaldığında, miniSOG-POI ifade eden hücreler, etkileşimli proteinleri değiştiren ancak bağlayıcı olmayan proteinleri değiştirmeyen tekli oksijen üretir.Fotooksidasyonun ara ürünleri, kovalent eklentiler oluşturmak için amin kimyasal probunun röle etiketleri tarafından yakalanır.Kimya probu üzerindeki alkinil grubu, aşağı çekme ve ardından LC-MS/MS niceleme ile zenginleştirme için tıklama kimyasına izin verir.b Amin problarının kimyasal yapısı 1-4.c Mitokondriyal lokalize miniSOG aracılı proteomik belirteçlerin 1-4 probları kullanılarak temsili floresan jel analizi ve jel dansitometrisine dayalı nispi niceleme.Kimyasal probların sinyal-arka plan oranı, mavi ışık hariç negatif kontrol deneyleri veya miniSOG ifadesi olmayan HEK293T hücreleri kullanılarak değerlendirildi.n = 2 biyolojik olarak bağımsız numune.Her nokta biyolojik bir kopyayı temsil eder.d c gibi belirtilen PDPL bileşenlerinin varlığında veya yokluğunda optimize edilmiş prob 3 kullanılarak PDPL'nin temsili tespiti ve nicelenmesi.n = 3 biyolojik olarak bağımsız numune.Her nokta biyolojik bir kopyayı temsil eder.Merkez çizgileri ve bıyıklar, ortalama ve ± standart sapmayı temsil eder.CBB: Coomassie Parlak Mavi.e Uzak kırmızı Si-DMA boyası ile tekli oksijenin konfokal görüntülemesi.Ölçek çubuğu: 10 µm.Jel görüntüleme ve konfokal deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı.
İlk önce, HEK293T'de stabil bir şekilde eksprese edilen olgun ışığa duyarlılaştırıcılar miniSOG26 ve KillerRed23'ün, proteomun kimyasal bir prob olarak propargilamin etiketlemesine aracılık etme kabiliyetini test ettik (Ek Şekil 1a).Jel floresan analizi, miniSOG ve mavi ışık ışıması kullanılarak tüm proteom etiketlemesinin sağlandığını, KillerRed ile görünür etiketleme ürününün gözlemlenmediğini gösterdi.Sinyal-arka plan oranını iyileştirmek için, anilin (1 ve 3), propilamin (2) veya benzilamin (4) içeren bir dizi kimyasal prob test ettik.HEK293T hücrelerinin kendilerinin, muhtemelen endojen riboflavin ışığa duyarlılaştırıcı, flavin mononükleotid (FMN) 27 nedeniyle, mavi ışık olmamasına kıyasla daha yüksek bir arka plan sinyaline sahip olduğunu gözlemledik. Anilin bazlı kimyasal problar 1 ve 3 daha iyi özgüllük verdi; HEK293T, mitokondride miniSOG'u stabil bir şekilde eksprese ederken, prob 3 için sinyalde >8 katlık bir artış gösterirken, RNA etiketleme yönteminde kullanılan prob 2 sadece ~2.5- muhtemelen RNA ve protein arasındaki farklı reaktivite tercihlerinden dolayı kat sinyali artışı (Şekil 1b, c). Anilin bazlı kimyasal problar 1 ve 3 daha iyi özgüllük verdi; HEK293T, mitokondride miniSOG'u stabil bir şekilde eksprese ederken, prob 3 için sinyalde >8 katlık bir artış gösterirken, RNA etiketleme yönteminde kullanılan prob 2 sadece ~2.5- muhtemelen RNA ve protein arasındaki farklı reaktivite tercihlerinden dolayı kat sinyali artışı (Şekil 1b, c).Anilin bazlı kimyasal problar 1 ve 3 daha iyi özgüllük gösterdi: mitokondride miniSOG'u stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T, prob 3 için sinyalde 8 kattan fazla bir artış gösterirken, prob 2, sadece CAP-seq RNA etiketleme yönteminde kullanılır. muhtemelen RNA ve protein arasındaki farklı reaktivite tercihlerinden dolayı ~2.5 kat sinyal artışı gösterir (Şekil 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 ， ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilin bazlı kimyasal problar 1 ve 3 daha iyi özgüllüğe sahipti, HEK293T mitokondride miniSOG'u stabil bir şekilde eksprese etti ve prob 3 sinyalde 8 kattan fazla artışa sahipken, CAP-seq RNA etiketleme yöntemi için prob 2 sadece ~2.5 kat artış gösterdi.sinyalde, muhtemelen RNA ve protein arasındaki farklı reaksiyon tercihlerinden dolayı (Şekil 1b, c).Ek olarak, sonda 3 izomerleri ve hidrazin sondaları (sonda 5, 6, 7) test edildi ve sonda 3'ün optimizasyonu doğrulandı (Ek Şekil 1b,c).Benzer şekilde, jel içi floresan analizi, diğer optimize edilmiş deneysel parametreleri ortaya çıkardı: ışınlama dalga boyu (460 nm), kimyasal prob konsantrasyonu (1 mM) ve ışınlama süresi (20 dakika) (Ek Şekil 2a–c).PDPL protokolünde herhangi bir bileşenin veya adımın atlanması, arka plana önemli bir sinyal dönüşü ile sonuçlandı (Şekil 1d).Özellikle, singlet oksijeni söndürdüğü bilinen sodyum azid veya troloks varlığında protein etiketlemesi önemli ölçüde azaldı.Singlet oksijeni stabilize ettiği bilinen D2O'nun varlığı, etiketleme sinyalini arttırır.Diğer reaktif oksijen türlerinin etiketlemeye katkısını araştırmak için sırasıyla hidroksil ve süperoksit radikal temizleyicileri oluşturmak için mannitol ve C vitamini eklendi, 18, 29, ancak etiketlemeyi azalttığı bulunmadı.H2O2 ilavesi, ancak aydınlatma değil, etiketleme ile sonuçlanmadı (Ek Şekil 3a).Si-DMA probları ile floresan singlet oksijen görüntüleme, HEK293T-miniSOG telinde singlet oksijenin varlığını doğruladı, ancak orijinal HEK293T telinde değil.Ek olarak, mitoSOX Red, aydınlatmadan sonra süperoksit üretimini tespit edemedi (Şekil 1e ve Ek Şekil 3b) 30. Bu veriler, singlet oksijenin sonraki proteomik etiketlemeden sorumlu ana reaktif oksijen türü olduğunu kuvvetle önerir.PDPL'nin sitotoksisitesi, mavi ışık ışınlaması ve kimyasal problar dahil olmak üzere değerlendirildi ve önemli bir sitotoksisite gözlenmedi (Ek Şekil 4a).
Etiketleme mekanizmasını incelemek ve LC-MS/MS kullanarak protein komplekslerinin proteomik tanımlanmasını sağlamak için önce hangi amino asitlerin değiştirildiğini ve prob etiketlerinin delta kütlesini belirlememiz gerekir.Metionin, histidin, triptofan ve tirozinin singlet oksijen14,15 tarafından değiştirildiği bildirilmiştir.TOP-ABPP31 iş akışını, MSFragger32'ye dayalı FragPipe bilgi işlem platformu tarafından sağlanan tarafsız açık arama ile entegre ediyoruz.Singlet oksijen modifikasyonu ve kimyasal prob etiketlemesinden sonra, parçalanabilir bir bağlayıcı içeren bir biyotin indirgeme etiketi kullanılarak tıklama kimyası yapıldı, ardından nötravidin gerdirme ve tripsin sindirimi yapıldı.Hâlâ reçineye bağlı olan modifiye edilmiş peptit, LC-MS/MS analizi için foto parçalandı (Şekil 2a ve Ek Veri 1).Listelenen 50'den fazla peptit haritası (PSM) eşleşmesiyle proteom boyunca çok sayıda modifikasyon meydana geldi (Şekil 2b).Şaşırtıcı bir şekilde, muhtemelen oksitlenmiş histidinin anilin problarına karşı diğer amino asitlere göre daha yüksek reaktivitesinden dolayı histidinin modifikasyonunu gözlemledik.Tekli oksijenle histidin oksidasyonunun yayınlanmış mekanizmasına göre,21,33 önerilen +229 Da'lık delta-kütle yapısı, iki oksidasyondan sonra prob 3'ün 2-okso-histidin ile eklenmesine karşılık gelirken, +247 Da hidroliz ürünüdür. +229 Da (Ek Şekil 5).MS2 spektrumunun değerlendirilmesi, modifiye fragman iyonlarının (y ve b) tanımlanması da dahil olmak üzere, y ve b iyonlarının çoğunun tanımlanmasında yüksek bir güvenilirlik göstermiştir (Şekil 2c).PDPL ile modifiye edilmiş histidinlerin lokal dizisinin bağlam analizi, ±1 pozisyonlarında küçük hidrofobik kalıntılar için orta derecede bir motif tercihi ortaya çıkardı (Ek Şekil 4b).Ortalama olarak, protein başına 1.4 histidin tanımlandı ve bu markörlerin bölgeleri, solvent erişilebilir yüzey alanı (SASA) ve nispi solvent mevcudiyeti (RSA) analizi ile belirlendi (Ek Şekil 4c, d).
MSFragger tarafından desteklenen FragPipe bilgi işlem platformunu kullanarak artık seçiciliği incelemek için tarafsız bir iş akışı.Parçalanabilir bağlayıcılar, streptavidin reçinesinden modifiye edilmiş peptitlerin fotoklevajını sağlamak için Click kimyasında kullanılır.Çok sayıda değişikliğin yanı sıra ilgili kalıntıları belirlemek için açık bir arama başlatıldı.b Proteom boyunca meydana gelen değişikliklerin kütlesini atayın.Peptit haritalama PSM.c Sonda 3 ile modifiye edilmiş histidin bölgelerinin MS2 spektral açıklaması. Temsili bir örnek olarak, modifiye amino aside +229.0938 Da eklenmiş sonda 3 ile bir kovalent reaksiyon.d PDPL belirteçlerini test etmek için kullanılan mutasyon testi.PRDX3 (H155A, H225A) ve PRDX1 (H10A, H81A, H169A), anti-Flag tespiti için vahşi tip plazmitlerle transfekte edildi.e Sentetik peptit, prob 3 varlığında saflaştırılmış miniSOG ile reaksiyona sokuldu ve LC-MS spektrumunda Δm +247 ve +229 ile ilgili ürünler not edildi.f miniSOG-6xHis-tag ve anti-6xHis antikoru ile modellenen in vitro protein-protein etkileşimleri.Işığa maruz kalma süresine bağlı olarak, prob 3 ile etiketlenmiş miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikor komplekslerinin antibiyotin (streptavidin-HRP) ve anti-fare Western blot analizi.Tek tek proteinler için etiketler, karşılık gelen moleküler ağırlıkta ifade edilir: LC antikoru hafif zinciri, HC antikoru ağır zinciri.Bu deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı.
Etiketleme bölgesinin biyokimyasal doğrulaması için kütle spektrometrisi ile tanımlanan PRDX3 ve PRDX1, histidinden alanine değiştirildi ve transfeksiyon deneylerinde vahşi tip ile karşılaştırıldı.PDPL sonuçları, mutasyonun etiketlemeyi önemli ölçüde azalttığını gösterdi (Şekil 2d).Bu arada, açık aramada tanımlanan peptit dizileri sentezlendi ve in vitro olarak, prob 3 ve mavi ışık varlığında saflaştırılmış miniSOG ile reaksiyona sokuldu, LC-MS ile tespit edildiğinde +247 ve +229 Da kütle kayması olan ürünler verdi (Şekil 1a). .2e).).Etkileşen proksimal proteinlerin miniSOG fotoaktivasyonuna yanıt olarak in vitro olarak etiketlenip etiketlenmediğini test etmek için, miniSOG-6xHis proteini ile bir anti-His monoklonal antikoru arasında in vitro etkileşim yoluyla yapay bir yakınlık tahlili tasarladık (Şekil 2f).Bu tahlilde, miniSOG ile antikor ağır ve hafif zincirlerinin proksimal etiketlenmesini bekledik.Aslında, anti-fare (anti-6xHis etiketli antikorun ağır ve hafif zincirlerini tanıyarak) ve streptavidin Western lekeleri, ağır ve hafif zincirlerin güçlü biyotinilasyonunu gösterdi.Özellikle, 6xHis etiketi ve hafif ve ağır zincirler arasındaki çapraz bağlar nedeniyle miniSOG otobiyotinilasyonunu fark ettik; bu, lizin ve 2-okso-histidin proksimal tepkisi arasındaki daha önce açıklanan boşlukla ilişkili olabilir.Sonuç olarak, PDPL'nin histidini yakınlığa bağlı bir şekilde değiştirdiği sonucuna varıyoruz.
Bir sonraki hedefimiz, yerinde etiketlemenin özgüllüğünü test etmek için hücre altı proteomunu karakterize etmekti.Bu nedenle, miniSOG'u HEK293T hücrelerinin çekirdeğinde, mitokondriyal matrisinde veya dış ER zarında kararlı bir şekilde ifade ettik (Şekil 3a).Jel floresan analizi, farklı etiketleme paternlerinin yanı sıra üç hücre altı lokasyonda bol miktarda etiketlenmiş bant ortaya çıkardı (Şekil 3b).Floresan görüntüleme analizi, PDPL'nin yüksek özgüllüğünü gösterdi (Şekil 3c).PDPL iş akışını, floresan mikroskobu kullanarak hücre altı proteomları tanımlamak için rodamin boyaları ile tıklama reaksiyonları takip etti ve PDPL sinyalleri, PDPL'nin yüksek sadakatini teyit ederek DAPI, mitokondriyal izleyiciler veya ER izleyiciler ile birlikte yerleştirildi.Üç organel konumu için, avidin western blot kullanılarak PDPL ile TurboID'nin yan yana karşılaştırılması, PDPL'nin ilgili kontrollere kıyasla daha spesifik olarak etiketlendiğini gösterdi.PDPL koşulları altında, daha fazla PDPL etiketli proteini gösteren daha fazla etiketli bant ortaya çıktı (Ek Şekil 6a-d).
miniSOG aracılı organele özgü proteom etiketlemesinin şematik temsili.miniSOG, insan COX4'ün (mito-miniSOG) N-terminal 23 amino asidine füzyon yoluyla mitokondriyal matrisi, H2B'ye (nükleus-miniSOG) füzyon yoluyla çekirdeği ve ER zarının (ER-miniSOG) sitoplazmik tarafı yoluyla Sec61β'yi hedefler ).Endikasyonlar jel görüntüleme, konfokal görüntüleme ve kütle spektrometrisini içerir.b Üç organele özgü PDPL profilinin temsili jel görüntüleri.CBB Coomassie Parlak Mavi.c V5 (kırmızı) etiketli antikor tarafından tespit edilen farklı hücre altı lokalizasyonları ile miniSOG'u stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri.Hücre altı belirteçler mitokondri ve ER (yeşil) için kullanılır.PDPL iş akışı, Cy3-azid tıklama kimyası kullanılarak miniSOG (sarı) etiketli hücre altı proteomlarının saptanmasını içerir.Ölçek çubuğu: 10 µm.d Çeşitli organellerdeki PDPL etiketli proteomların, etiketlenmemiş nicelemeyle niceliği belirlenen volkanik çizimleri (n = 3 bağımsız biyolojik deney).Volkan arazilerinde iki kuyruklu Student t testi kullanıldı.Negatif kontrol olarak HEK293T vahşi tip kullanıldı. Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızı renkle vurgulanır (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu farkı). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızı renkle vurgulanır (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu farkı). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızıyla vurgulanır (p < 0.05 ve iyon yoğunluğunda >2 kat fark).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızıyla vurgulanır (p < 0.05 ve iyonik kuvvette > 2 kat fark).HEK293T-miniSOG için önemli olan ancak HEK293T için önemli olmayan ilgili proteinler yeşil renkle gösterilmiştir.e Deneylerden elde edilen proteomik veri kümelerinin özgüllüğünün analizi d.Her organeldeki (kırmızı ve yeşil noktalar) istatistiksel olarak anlamlı proteinlerin toplam sayısı en üstte işaretlenmiştir.Histogramlar, MitoCarta 3.0, GO analizi ve A. Ting et al.insanlar.Mitokondri, çekirdek ve ER için ayrı veri kümeleri.Bu deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı.Ham veriler, ham veri dosyaları şeklinde sağlanır.
Jel ve görüntüleme sonuçlarıyla cesaretlendirilen, her organelde tanımlanan proteomu ölçmek için etiketsiz niceleme kullanıldı (Ek Veri 2).Transfekte edilmemiş HEK293T, arka plan işaretleyicilerini çıkarmak için bir negatif kontrol olarak kullanıldı. Volkan çizim analizi, önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinler (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu) ve ayrıca yalnızca miniSOG ifade eden hatlarda bulunan tekil proteinler (Şekil 3d kırmızı ve yeşil noktalar) gösterdi. Volkan çizim analizi, önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinler (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu) ve ayrıca yalnızca miniSOG ifade eden hatlarda bulunan tekil proteinler (Şekil 3d kırmızı ve yeşil noktalar) gösterdi. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Volkan grafiği analizi, önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinlerin (p<0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu) yanı sıra yalnızca miniSOG ifade eden hatlarda bulunan tekli proteinleri gösterdi (Şekil 3d, kırmızı ve yeşil noktalar).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Volkan grafiği analizi, önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinleri (p<0.05 ve >2x iyonik kuvvet) ve ayrıca sadece miniSOG ekspresyon hattında bulunan tekli proteinleri (Şekil 3d'de kırmızı ve yeşil noktalar) ortaya çıkardı.Bu verileri birleştirerek, sırasıyla 1364, 461 ve 911 istatistiksel olarak anlamlı nükleer, mitokondriyal ve ER dış zar proteinlerini belirledik.Organel lokalize PDPL'nin doğruluğunu analiz etmek için MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analizi ve A. Ting ve ark.mitokondri, çekirdek ve ER için tespit edilen proteinlerin organel özgüllüğünü test etmek için bir veri seti8 kullanıldı, bu da %73.4, %78.5 ve %73.0'lık bir doğruluğa karşılık geldi (Şekil 3e).PDPL'nin özgüllüğü, PDPL'nin organele özgü proteomları tanımlamak için ideal bir araç olduğunu doğrular.Özellikle, tanımlanmış mitokondriyal proteinlerin gönderokondriyal analizi, yakalanan proteomun esas olarak matris ve iç zarda (sırasıyla 226 ve 106) dağıldığını ve tanımlanmış toplam mitokondriyal protein sayısının %91.7'sini (362) oluşturduğunu göstermiştir.ayrıca yüksek bir PDPL seviyesi de doğrulandı (Ek Şekil 7a).Benzer şekilde, subnükleer analiz, yakalanan proteomun esas olarak çekirdek, nükleoplazma ve nükleolde dağıldığını gösterdi (Ek Şekil 7b).Bir nükleer lokalizasyon sinyal peptidi (3xNLS) ile nükleer proteomik analiz, H2B yapısına benzer doğruluk gösterdi (Ek Şekil 7c–h).PDPL işaretçisinin özgüllüğünü belirlemek için nükleer laminin A, daha ayrı bir şekilde lokalize bir POI7 tuzağı olarak seçildi.PDPL, önemli ölçüde zenginleştirilmiş 36 protein tanımladı; bunların 12 proteini (lamin A dahil %30.0) iyi karakterize edilmiş lamin A etkileşimli proteinlerdi ve String veri tabanı tarafından açıklanmış, BioID yönteminden (122 protein) daha yüksek bir yüzdeyle 28/28. , 22.9 %) 7. Yöntemimiz, muhtemelen daha aktif singlet oksijen tarafından mümkün kılınan sınırlı etiketleme alanları nedeniyle daha az protein tanımladı.GO analizi, tanımlanan proteinlerin esas olarak nükleoplazmada (26), nükleer membranda (10), nükleer membranda (9) ve nükleer gözeneklerde (5) bulunduğunu gösterdi.Toplu olarak, bu nükleer lokalize proteinler, zenginleştirilmiş proteinlerin% 80'ini oluşturdu ve ayrıca PDPL'nin özgüllüğünü gösterdi (Ek Şekil 8a-d).
PDPL'nin organellerde yakınlık işaretlemesi yapma yeteneğini belirledikten sonra, PDPL'nin POI bağlama ortaklarını analiz etmek için kullanılıp kullanılamayacağını test ettik.Özellikle, yüksek dinamik yapıları nedeniyle membran lokalize muadillerinden daha zor hedefler olarak kabul edilen sitozolik proteinlerin PDPL analizini tanımlamaya çalıştık.Bromodomain ve ekstraterminal (BET) proteini BRD4, çeşitli hastalıklarda 35, 36 anahtar rolü nedeniyle dikkatimizi çekmiştir.BRD4 tarafından oluşturulan kompleks, bir transkripsiyonel koaktivatör ve önemli bir terapötik hedeftir.c-myc ve Wnt5a transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu düzenleyerek, BRD4'ün akut miyeloid lösemi (AML), multipl miyelom, Burkitt lenfoması, kolon kanseri ve inflamatuar hastalıkların anahtar belirleyicisi olduğu düşünülmektedir37,38.Ayrıca bazı virüsler, papillomavirüs, HIV ve SARS-CoV-236,39 gibi viral ve hücresel transkripsiyonu düzenlemek için BRD4'ü hedefler.
PDPL kullanarak BRD4 etkileşimini haritalamak için miniSOG'u kısa bir N- veya C-terminal BRD4 izoformu ile birleştirdik.Proteomik sonuçlar, iki yapı arasında yüksek derecede örtüşme olduğunu ortaya koydu (Ek Şekil 9a).miniSOG-H2B ile tanımlanan nükleer proteom, BRD4 ile etkileşime giren proteinlerin %77.6'sını kapsar (Ek Şekil 9b).Ardından, işaretçi yarıçapını ayarlamak için farklı aydınlatma süreleri (2, 5, 10, 20 dakika) kullanıldı (Şekil 4a ve ek veriler 3).Daha kısa fotoperiyotlarda, PDPL'nin öncelikle doğrudan bağlanma ortaklarını etiketleyeceği, daha uzun periyotların ise daha kısa fotoaktivasyon periyotlarında tanımlanan proteinleri ve ayrıca etiketleme komplekslerindeki dolaylı hedefleri içereceği sonucuna vardık.Aslında, bitişik zaman noktaları arasında güçlü bir örtüşme bulduk (2 ve 5 dakika için %84.6; 5 ve 10 dakika için %87.7; 10 ve 20 dakika için %98.7) (Şekil 4b ve Ek Şekil 9c).Tüm deney gruplarında, yalnızca BRD4 kendi kendini etiketlemeyi değil, aynı zamanda dize veritabanında açıklamalı MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ve HMGB1 gibi bilinen birkaç hedefi de bulduk.Bu hedeflerin iyonik gücü, maruz kalma süresi ile orantılıdır (Şekil 4c ve Ek Şekil 9d).2 dakikalık grupta tanımlanan proteinlerin GO analizi, tanımlanan proteinlerin çekirdekte lokalize olduğunu ve kromatin yeniden şekillenmesi ve RNA polimeraz işlevinde yer aldığını gösterdi.Proteinin moleküler işlevi, BRD4 işleviyle tutarlı olarak kromatin bağlanması veya transkripsiyonel koaktivasyonda zenginleştirildi (Şekil 4d).Dizi veritabanı etkin protein etkileşimi analizi, BRD4 ve HDAC bağlayıcı asetillenmiş histonlarla tutarlı olarak BRD4 ve SIN3A, NCOR2, BCOR ve SAP130 (Şekil 4e ve Ek Şekil 9e) gibi HDAC ailesi etkileşimli kompleksler arasında birinci düzeyde dolaylı etkileşimler ortaya çıkardı. ..Ek olarak, Sin3A, NSUN2, Fus ve SFPQ dahil olmak üzere LC-MS/MS tarafından tanımlanan temsili hedefler Western blotlama ile doğrulandı (Şekil 4f).Son zamanlarda, BRD4'ün kısa izoformunun, sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) özelliklerine sahip çekirdekler oluşturduğu bildirilmiştir.RNA bağlayıcı proteinler Fus ve SFPQ, çeşitli hücresel süreçlerin LLPS'sine aracılık eder ve burada kaydedilmemiş BRD4 bağlayıcı proteinler olarak tanımlanmıştır.BRD4 ve SFPQ arasındaki etkileşim, ortak immünopresipitasyon (ortak IP) deneyleri ile doğrulandı (Şekil 4g), BRD4 aracılı sıvı-sıvı faz ayrımı için daha fazla araştırmayı hak eden başka bir mekanizma önerdi.Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PDPL'nin bilinen BRD4 ile etkileşime giren ve bilinmeyen bağlayıcı proteinleri tanımlamak için ideal bir platform olduğunu göstermektedir.
a miniSOG aracılı BRD4 yakınlık işaretlemesinin şematik gösterimi, maruz kalma süreleri: 2, 5, 10 ve 20 dk.b Farklı aydınlatma sürelerinde tanımlanan proteinlerin örtüşmesi.HEK293T-miniSOG-BRD4'te tanımlanan protein zenginleştirmesi, vahşi tip HEK293T'ye kıyasla istatistiksel olarak anlamlıydı.c Belirtilen maruz kalma süresi boyunca etiketlenmemiş temsili bilinen BRD4 bağlayıcı proteinleri ölçerken iyon yoğunluğu.n = 3 biyolojik olarak bağımsız numune.Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur.d 2 dakikalık grupta tanımlanan proteinlerin gen ontolojik analizi (GO).İlk on GO terimi listelenir.Kabarcıklar GO terimi kategorisine göre renklendirilir ve kabarcık boyutu her terimde bulunan protein sayısıyla orantılıdır.e BRD4 ile etkileşime giren proteinlerin dizi analizi.Sarı daireler doğrudan yapıştırıcıdır ve gri daireler dolaylı yapıştırıcının ilk tabakasıdır.Kırmızı çizgiler deneysel olarak belirlenmiş etkileşimleri temsil eder ve mavi çizgiler tahmin edilen etkileşimleri temsil eder.f LC-MS/MS'de tanımlanan temsili BRD4 bağlanma hedefleri, Western blot ile doğrulandı.g Ortak immünopresipitasyon deneyleri, SFPQ ve BRD4 arasındaki etkileşimi doğrular.Bu deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı.Ham veriler, ham veri dosyaları şeklinde sağlanır.
Kayıtlı olmayan POI ile ilişkili hedefleri tanımlamaya ek olarak, PDPL'nin enzimler için substratları tanımlamak için uygun olacağını varsayıyoruz, bu da kayıtlı olmayan substratları açıklamak için büyük komplekslerde dolaylı bağlayıcı proteinlerin karakterizasyonunu gerektirecektir.Parkin (PARK2 tarafından kodlanır) bir E3 ligazdır ve parkindeki mutasyonların otozomal resesif jüvenil Parkinson hastalığına (AR-JP) neden olduğu bilinmektedir42.Ek olarak, parkin, mitofajinin (mitokondriyal otofaji) ve reaktif oksijen türlerinin uzaklaştırılması için gerekli olarak tanımlanmıştır.Bununla birlikte, birkaç parkin substratı tanımlanmış olmasına rağmen, parkinin bu hastalıktaki rolü belirsizliğini koruyor.Karakterize edilmemiş alt katmanlarına açıklama eklemek için PDPL, parkinin N veya C terminaline miniSOG eklenerek test edildi.Hücreler, PINK1-Parkin yolu yoluyla parkini aktive etmek için karbonil siyanür proton taşıyıcı m-klorofenilhidrazon (CCCP) ile işlendi.BRD4 PDPL sonuçlarımızla karşılaştırıldığında, parkin N-terminali füzyonu, C-terminalinin daha büyük bir bölümünü (210 üzerinden 177) kapsamasına rağmen daha büyük bir hedef protein seti ortaya çıkardı (Şekil 5a,b ve Ek Veri 4).sonuç, N-terminal etiketlerinin Parkin44'ü anormal şekilde etkinleştirebileceğine dair raporlarla tutarlıdır.Şaşırtıcı bir şekilde, muhtemelen hücre hatları ve proteomik iş akışları arasındaki farklılıklar nedeniyle, Parkin43 için yayınlanan AP-MS sonuçlarıyla verilerimizde yalnızca 18 örtüşen protein vardı.İki yöntemle tanımlanan dört bilinen proteine (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ve PSMC3) ek olarak (Şekil 5c)43.LC-MS/MS sonuçlarını daha fazla doğrulamak için PDPL tedavisi ve ardından Western blot işlemi, HEK293T ana hücre testinin ve stabil N-terminal parkin hattının sonuçlarını karşılaştırmak için kullanıldı.Önceden bilinmeyen hedefler CDK2, DUT, CTBP1 ve PSMC4, bilinen bir bağlayıcı olan DNAJB1 ile test edildi (Şekil 5d).
HEK293T hücrelerinde, parkinin N- veya C-terminaline kaynaşmış kararlı şekilde eksprese edilmiş miniSOG ile parkinle etkileşime giren proteinlerin volkan grafiği (n = 3 bağımsız biyolojik deney).Volkan arazilerinde iki kuyruklu Student t testi kullanıldı.Negatif kontrol olarak HEK293T kullanıldı. Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızı renkle vurgulanır (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu farkı). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızı renkle vurgulanır (p < 0.05 ve >2 kat iyon yoğunluğu farkı). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızıyla vurgulanır (p < 0.05 ve iyon yoğunluğunda >2 kat fark).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Önemli ölçüde değiştirilmiş proteinler kırmızıyla vurgulanır (p < 0.05 ve iyonik kuvvette > 2 kat fark).HEK293T-miniSOG için önemli olan ancak HEK293T için önemli olmayan ilgili proteinler yeşil renkle gösterilmiştir.b N-terminal ve C-terminal yapıları arasındaki örtüşen proteinleri gösteren Venn şeması.N-terminal etiketleri, parkini anormal şekilde aktive edebilir ve daha tanınabilir proteinlerle sonuçlanabilir.c PDPL ve AP-MS arasındaki örtüşen proteinleri gösteren Venn şeması.PDPL'de spesifik olarak tanımlanmış 18 örtüşen proteinden 4'ü ve 159 proteinden 11'i dahil olmak üzere bilinen etkileşimciler listelenmiştir.d LC-MS/MS tarafından tanımlanan temsili hedefler Western blot ile doğrulandı.e Ssu72 ve SNW1, kayıtlı olmayan parkin substratları olarak tanımlandı.Bu FLAG etiketli protein plazmitleri, HEK293T ve HEK293T-Parkin-miniSOG'a transfekte edildi, ardından çeşitli zaman noktalarında CCCP tedavisi yapıldı.Bozunma, Parkin aşırı ekspresyon hattında daha belirgindi.f Proteazom inhibitörü MG132 kullanılarak, Ssu72 ve SNW1'in bozunma sürecine proteazom-ubiquitination aracılık ettiği doğrulandı.Bu deneyler, benzer sonuçlarla bağımsız olarak en az iki kez tekrarlandı.Ham veriler, ham veri dosyaları şeklinde sağlanır.
Özellikle, PDPL tarafından tanımlanan proteinler, parkin bağlayıcı proteinleri ve bunların substratlarını içermelidir.Kayıtlı olmayan parkin substratlarını tespit etmek için, bu genleri normal HEK293T'ye maruz bırakmak ve kararlı bir şekilde miniSOG-Parkin'in HEK293T'sini ve ardından CCCP tedavisini eksprese etmek için tanımlanmış yedi protein (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ve SNW1) ve transfekte edilmiş plazmitler seçtik.Ssu72 ve SNW1 proteinlerinin seviyeleri, stabil miniSOG-Parkin hattında önemli ölçüde azaldı (Şekil 5e).12 saat boyunca CCCP ile muamele, her iki substratın da en önemli bozunmasıyla sonuçlandı.Ssu72 ve SNW1'in bozunmasının proteazom-ubiquitination tarafından düzenlenip düzenlenmediğini araştırmak için, proteazom aktivitesini inhibe etmek için proteazom inhibitörü MG132 ilave edildi ve aslında onların bozunma prosesinin inhibe edildiğini bulduk (Şekil 5f).Ek substrat dışı hedefler, LC-MS/MS ile tutarlı sonuçlar gösteren Western blot (Ek Şekil 10) kullanılarak Parkin etkileşimcileri olarak doğrulandı.Sonuç olarak, PDPL iş akışının hedef protein transfeksiyon doğrulaması ile entegrasyonu, kayıtlı olmayan E3 ligaz substratlarının tanımlanmasına izin verir.
Uzay ve zaman etkileşimli İÇN'leri tanımlamanıza olanak tanıyan ortak bir yakınlık işaretleme platformu geliştirdik.Platform, yalnızca yaklaşık 12 kDa olan, olgun APEX2 enziminin (27 kDa) yarısından daha küçük ve TurboID'nin (35 kDa) üçte biri büyüklüğündeki miniSOG ışığa duyarlılaştırıcı proteine dayanmaktadır.Daha küçük boyut, küçük protein interaktomlarını incelemek için uygulama aralığını büyük ölçüde genişletmelidir.Singlet oksijenin kuantum verimini artırmak ve bu yaklaşımın duyarlılığını genişletmek için, genetik olarak kodlanmış proteinler veya küçük moleküller olsun, ek ışığa duyarlılaştırıcıların daha fazla araştırılması gerekir.MiniSOG'un mevcut sürümü için, yakınlık işaretçilerini etkinleştirmek için mavi aydınlatma kullanılarak yüksek zamansal çözünürlük elde edilebilir.Ek olarak, daha uzun maruz kalma süresi, daha büyük bir singlet oksijen "bulutunu" serbest bıraktı, bu da daha uzak histidin kalıntılarının modifikasyonu, artan etiketleme yarıçapı ve PDPL uzaysal çözünürlüğünde ince ayar yapma yeteneği ile sonuçlandı.Ayrıca sinyal-arka plan oranını artırmak için yedi kimyasal sondayı test ettik ve bu yaklaşımın arkasındaki moleküler mekanizmayı araştırdık.Tarafsız açık arama ile birleştirilmiş TOP-ABPP iş akışı, modifikasyonların yalnızca histidinlerde meydana geldiğini ve döngü bölgesindeki histidinlerin orta derecede tercih edilmesi dışında, artan histidin modifikasyonları için tutarlı bir mikro-ortam gözlemlenmediğini doğruladı.
PDPL ayrıca, en azından diğer yakınlık etiketleme ve organele özgü kimyasal prob yöntemleriyle karşılaştırılabilir proteom özgüllüğü ve kapsamı ile hücre altı proteomları karakterize etmek için kullanılmıştır.Yakınlık belirteçleri ayrıca yüzey, lizozomal ve sekretomla ilişkili proteomları 46,47 karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır.PDPL'nin bu hücre içi organellerle uyumlu olacağına inanıyoruz.Ek olarak, dinamik özellikleri ve daha geçici etkileşimlere dahil olmaları nedeniyle membrana bağlı proteinlerden daha karmaşık olan sitozolik protein bağlanması için hedefler belirleyerek PDPL'ye meydan okuduk.PDPL, iki proteine, transkripsiyonel koaktivatör BRD4'e ve hastalıkla ilişkili ligaz E3 Parkin'e uygulandı.Bu iki protein, yalnızca temel biyolojik işlevleri için değil, aynı zamanda klinik uygunlukları ve terapötik potansiyelleri için de seçilmiştir.Bu iki POI için, iyi bilinen bağlayıcı ortaklar ve kayıtlı olmayan hedefler belirlendi.Özellikle, faz ayrımıyla ilişkili protein SFPQ, ortak IP ile doğrulandı; bu, BRD4'ün (kısa izoform) LLPS'yi düzenlediği yeni bir mekanizmayı gösterebilir.Aynı zamanda, Parkin substratlarının tanımlanmasının, dolaylı yapıştırıcıların tanımlanmasının gerekli olduğu bir senaryo olduğuna inanıyoruz.Tanımlanamayan iki parkin substratı belirledik ve bunların ubiquitination-proteasome yolu boyunca bozulmalarını doğruladık.Son zamanlarda, hidrolaz substratlarını enzimlerle yakalayarak tespit etmek için mekanizma tabanlı bir yakalama stratejisi geliştirilmiştir.Bu çok güçlü bir yöntem olmasına rağmen, büyük komplekslerin oluşumunda yer alan substratların analizi için uygun değildir ve enzim ile substrat arasında kovalent bağların oluşmasını gerektirir.PDPL'nin, deubiquitinase ve metalloproteaz aileleri gibi diğer protein komplekslerini ve enzim ailelerini incelemek için genişletilebileceğini umuyoruz.
SOPP3 adı verilen yeni bir miniSOG formu, geliştirilmiş singlet oksijen üretimi ile geliştirilmiştir.MiniSOG'u SOPP3 ile karşılaştırdık ve sinyal-gürültü oranı değişmeden kalmasına rağmen iyileştirilmiş işaretleme performansı bulduk (Ek Şekil 11).SOPP3'ün optimizasyonunun (örneğin yönlendirilmiş evrim yoluyla) daha kısa ışık süreleri gerektiren daha verimli ışığa duyarlılaştırıcı proteinlere yol açacağını ve böylece daha dinamik hücresel süreçlerin yakalanmasına izin vereceğini varsaydık.Özellikle, PDPL'nin mevcut sürümü, mavi ışık aydınlatması gerektirdiğinden ve derin dokulara nüfuz edemediğinden hücresel ortamla sınırlıdır.Bu özellik, hayvan modeli çalışmalarında kullanımını engellemektedir.Bununla birlikte, optogenetiğin PDPL ile kombinasyonu, özellikle beyinde hayvan araştırmaları için bir fırsat sağlayabilir.Ek olarak, diğer tasarlanmış kızılötesi ışığa duyarlılaştırıcılar da bu sınırlamayı ortadan kaldırır.Şu anda bu alanda araştırmalar yapılıyor.
HEK293T hücre çizgisi, ATCC'den (CRL-3216) elde edildi.Hücre çizgisi, mikoplazma enfeksiyonu için negatif olarak test edildi ve %10 fetal sığır serumu (FBS, Vistech, #SE100-B) ve %1 penisilin/streptomisin (Hyclone, #SV30010) ile desteklenmiş DMEM (Thermo, #C11995500BT) içinde kültürlendi.içinde büyüdü.
3-Aminofenilen (örnek 3) ve (4-etinilfenil)metanamin (örnek 4) Bidepharm'dan satın alındı.Propilamin (sonda 2) Energy-chemicals'dan satın alındı.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamid (sonda 1), yayınlanmış yöntemlere göre sentezlendi.
Ek Tablo 1, bu çalışmada kullanılan genetik yapıları listeler.miniSOG ve KillerRed dizileri, P. Zou'dan (Pekin Üniversitesi) bir hediye plazmitinden klonlandı.Mitokondriyal matris hedefleme dizisi, COX4'ün 23 N-terminal amino asidinden türetildi ve bir Gibson düzeneği (Beyotime, #D7010S) kullanılarak belirtilen vektörlere klonlandı.Endoplazmik retikulumun zarını ve çekirdeğini hedeflemek için, HEK293T hücrelerinin bir cDNA kitaplığından PCR ile amplifiye edilen SEC61B insan DNA'sı (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ve H2B DNA (D. Lin, Shenzhen Bay Laboratuvarı tarafından bağışlanmıştır) ve yukarıda belirtildiği gibi klonlanmıştır.Aksi belirtilmedikçe, transfeksiyon ve stabil hücre hatlarının inşası için kullanılan diğer protein genleri, HEK293T hücre cDNA kütüphanesinden PCR ile amplifiye edildi.Yem proteini ve miniSOG arasında bağlayıcı olarak G3S (GGGS) ve G4S (GGGGS) kullanıldı.Bu füzyon yapılarına bir V5 epitop etiketi (GKPIPNPLLGLDST) eklenmiştir.Memelilerde ekspresyon için ve stabil bir hücre çizgisi oluşturmak için miniSOG füzyon yapısı, pLX304 lentiviral vektörüne alt klonlandı.Bakteriyel ekspresyon için miniSOG, C-terminalinde 6xHis etiketli pET21a vektörüne klonlandı.
HEK293T hücreleri, altı oyuklu plakalarda oyuk başına 2.0 x 105 hücrede tohumlandı ve 24 saat sonra rekombinant lentiviral plazmitler (2.4 ug pLX304) ve viral paketleme plazmitleri (1.5 ug psPAX2 ve 1.2 ug pMD2.G) ile Lipo8000 (Beyotime) kullanılarak transfekte edildi. , #C0533), yaklaşık %80 füzyon.Gece boyunca transfeksiyondan sonra ortam değiştirildi ve 24 saat daha inkübe edildi.Virüsün toplanması 24, 48 ve 72 saat sonra gerçekleştirildi.Hedef hücre hatlarının enfeksiyonundan önce, viral ortam 0.8 um'lik bir filtreden (Merck, #millex-GP) süzüldü ve polibren (Solarbio, #H8761) 8 ug/ml'lik bir konsantrasyona eklendi.24 saat sonra, ortam değiştirilerek hücrelerin toparlanmasına izin verildi.Hücreler, daha düşük katı bir seçim olarak ilk üç pasaj için 5 ug/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) kullanılarak seçildi.Daha sonra sonraki üç pasaj için daha sıkı bir rejim olarak 20 μg/ml kullanıldı.
Hücreler, oyuk başına yaklaşık 20.000 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bölmelere (Ibidi, #81201) ekildi.HEK293T hücrelerinin yapışmasını iyileştirmek için, 37°C'de fosfat tamponlu salin (PBS, Sangon, #B640435) içinde seyreltilmiş 50 ug/ml fibronektin (Corning, #356008) ekleyin.Bölmeler 1 saat ön işleme tabi tutuldu ve ardından PBS ile çıkarıldı.24 saat sonra hücreler bir kez PBS ile yıkandı, taze Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS, Gibco, #14025092) 1 mM prob 3 ile 37°C'de 1 saat inkübe edildi ve ardından mavi LED (460 nm) ile inkübe edildi. ).) oda sıcaklığında 10 dakika ışınlandı.Bundan sonra hücreler iki kez PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS (Sangon, #E672002) içinde %4 formaldehit ile sabitlendi.Fazla formaldehit, PBS ile üç kez yıkanarak sabit hücrelerden çıkarıldı.Hücreler daha sonra PBS içinde %0.5 Triton X-100 (Sangon, #A600198) ile geçirgenleştirildi ve 3 kez PBS ile yıkandı.Ardından hazneyi çıkarın ve her numuneye 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) içeren 25 µl tıklama reaksiyon karışımı ekleyin. ve 0.5 mg/ml sodyum askorbat (Aladdin, no. S105024) ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi.Ani bir reaksiyondan sonra hücreler altı kez %0.05 Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) içeren PBS ile yıkandı ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST içinde %5 BSA (Abcone, #B24726) ile bloke edildi.
Kolokalizasyon immün boyama için hücreler, belirtilen koşullara göre birincil antikorlarla inkübe edildi: fare anti-V5 etiketi mAb (1:500, CST, #80076), tavşan anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), tavşan poliklonal anti-kalneksin antikoru (1:500, Abcam, #ab22595) veya tavşan anti-lamin A/C monoklonal antikoru (1:500; CST, #2032) gece boyunca 4 °C'de.PBST ile 3 kez yıkandıktan sonra, hücreler ikincil antikorlarla inkübe edildi: 1:1000 seyreltilmiş keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), 1:1000 seyreltilmiş keçi anti-fare Alexa Fluor 594 (CST, #8889).seyreltme 30 dakika oda sıcaklığında seyreltin.Hücreler daha sonra 3 kez PBST ile yıkandı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde DAPI (Thermo, #D1306) ile zıt boyandı.PBS ile 3 yıkamadan sonra hücreler, görüntüleme için PBS içinde %50 gliserol (Sangon, #A600232) içinde kapatıldı.İmmünofloresan görüntüler, bir ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokal mikroskop ve ZNE 3.5 yazılımı kullanılarak elde edildi.
Singlet oksijen floresan görüntüleme için hücreler, Hanks HEPES tamponu (DOJINDO, #MT05) içinde 100 nM Si-DMA eklenmeden önce iki kez Hanks HEPES tamponu ile yıkandı.Işığa maruz bırakıldıktan sonra hücreler, 45 dakika süreyle 37°C'de bir CO2 inkübatöründe inkübe edildi.Hücreler daha sonra iki kez Hanks' HEPES tamponu ile yıkandı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Hanks' HEPES tamponunda Hoechst ile zıt boyandı ve bir ZEISS LSM 900 konfokal mikroskobu kullanılarak görselleştirildi., #M36008) kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS tamponunda.Işığa veya doksorubisine (MCE, #HY-15142A) maruz bırakıldıktan sonra hücreler, bir CO2 inkübatöründe 37°C'de 10 dakika inkübe edildi, iki kez HBSS tamponu ile yıkandı ve Hoechst ile oda sıcaklığında HBSS tamponunda inkübe edildi.dakika.Doksorubisin, hücrelerin 30 dakika boyunca %1 BSA içeren HBSS içinde 20 uM doksorubisin ile muamele edildiği bir pozitif prob kontrolü olarak kullanıldı.İmmünofloresan görüntüler, bir Zeiss LSM 900 konfokal mikroskobu kullanılarak elde edildi.
Mito-miniSOG'u kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293T hücreleri, 15 cm tabaklarda yaklaşık %30'luk bir yoğunlukta tohumlandı.48 saat sonra, ~%80 birleşme noktasına ulaşıldığında, hücreler bir kez PBS ile yıkandı, 1 mM Prob 3 ile taze HBSS tamponu içinde 1 saat süreyle 37°C'de inkübe edildi ve ardından odada 10 dakika boyunca mavi bir LED ile aydınlatıldı. sıcaklık..Daha sonra hücreler iki kez PBS ile yıkandı, kazındı ve EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri (MCE, #HY-K0011) içeren buz gibi soğuk PBS tamponu içinde yeniden süspanse edildi.Hücreler, ucun 1 dakika süreyle sonikasyona tabi tutulmasıyla parçalandı (%35 amplitüdde 1 saniye açık ve 1 saniye kapalı).Elde edilen karışım, kalıntıları uzaklaştırmak için 4°C'de 10 dakika boyunca 15.871 xg'de santrifüjlendi ve süpernatant konsantrasyonu, bir BCA protein tahlil kiti (Beyotime, #P0009) kullanılarak 4 mg/mL'ye ayarlandı.0.1 mM ışıkla bozunabilir biyotin azid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437) ve 1 mM CuSO4 inkübatörü ile yukarıdaki lizatın 1 ml'sini birleştirin. oda sıcaklığında 1 saat kadar döndürün.Ani bir reaksiyondan sonra, karışımı 10 ml'lik bir cam şişe içinde önceden karıştırılmış çözeltiye (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ekleyin.Numuneler karıştırıldı ve oda sıcaklığında 4500 g'de 10 dakika santrifüjlendi.Alt ve üst çözeltiler atıldı, çökelti iki kez 1 ml metanol ile yıkandı ve 15871 x g'de 4°C'de 5 dakika santrifüjlendi.Çökeltiyi çözmek için 25 mM amonyum bikarbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) içinde 1 ml 8 M üre (Aladdin, no. U111902) ekleyin.Örnekler, 10 mM ditiyotreitol (Sangon, #A100281, 25 mM ABC'de) ile 40 dakika boyunca 55°C'de yeniden oluşturuldu, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 15 mM taze iyodoasetamid (Sangon, #A600539) ilave edildi.30 dakika içinde alkilasyon..Reaksiyonu durdurmak için ilave 5 mM ditiyotreitol eklendi.1 ml PBS ile 3 kez yıkayarak her numune için yaklaşık 100 µl NeutrAvidin agaroz boncukları (Thermo, #29202) hazırlayın.Yukarıdaki proteom çözeltisi, 5 ml PBS ile seyreltildi ve önceden yıkanmış NeutrAvidin agaroz boncukları ile 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi.Boncuklar daha sonra 3 kez %0.2 SDS içeren 5 ml PBS (Sangon, #A600485), 3 kez İM üre içeren 5 ml PBS ve 3 kez 5 ml ddH2O ile yıkandı.Boncuklar daha sonra santrifüjleme ile toplandı ve 1 M üre, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) ve 20 ng/ul tripsin (Promega, #V5280) içeren 200 ul 25 mM ABC içinde yeniden süspanse edildi.Bir gecede 37°C'de rotasyonla tripsinize edin.Reaksiyon, pH 2-3'e ulaşana kadar formik asit (Thermo, # A117-50) eklenerek durduruldu.Boncuklar 3 kez %0.2 SDS içeren 1 ml PBS ile, 3 kez 1 M üre içeren 1 ml PBS ile ve ardından 3 kez 1 ml distile su ile yıkandı.Modifiye edilmiş peptitler, 200 ul %70 MeOH kullanılarak 90 dakika boyunca hafif liziz (365 nm) ile serbest bırakıldı.Santrifüjden sonra süpernatant toplandı.Boncuklar daha sonra bir kez 100 ul %70 MeOH ile yıkandı ve süpernatanlar toplandı.Örnekler bir Speedvac vakumlu yoğunlaştırıcıda kurutuldu ve analize kadar -20°C'de saklandı.
Singlet oksijen ile modifiye edilmiş peptitleri tanımlamak ve ölçmek için numuneler %0,1 formik asit içinde yeniden çözündürüldü ve 1 μg peptit, Tune'dan bir nano ESI kaynağı ve satıcı yazılımı 4.3'ten Xcalibur ile donatılmış bir Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildi.Örnekler, 3 um C18 malzemesi (ReproSil-pur, #r13.b9.) ile 75 um x 15 cm dahili olarak paketlenmiş kapiler kolon üzerinde ayrıldı ve bir EASY-nLC 1200 UHPLC sistemine (Thermo) bağlandı.Peptitler, %8 solvent B'den %50 solvent B'ye (A = su içinde %0.1 formik asit, B = %80 asetonitril içinde %0.1 formik asit) lineer 95 dakikalık gradyan kromatografisiyle ayrıldı, daha sonra lineer olarak %98 B dakikaya yükseltildi 300 nl/dk'lık bir akış hızında 6 dakikada.Orbitrap Fusion Lumos, verilere bağlı olarak tam MS taraması ve MS2 taraması arasında dönüşümlü olarak veri toplar.Püskürtme voltajı 2.1 kV'a ayarlandı ve iyon taşıma kılcalının sıcaklığı 320°C idi.MS spektrumları (350-2000 m/z), 120.000 çözünürlük, AGC 4 × 105 ve maksimum 150 ms giriş süresi ile toplanmıştır.Her tam taramada en yaygın 10 çok yüklü öncü, %30 normalize çarpışma enerjisi, 1,6 m/z dört kutuplu izolasyon penceresi ve 30.000 çözünürlük ayarı ile HCD kullanılarak parçalandı.5×104 ve maksimum giriş süresi 150 ms olan tandem kütle spektrometrisi için bir AGC hedefi.Dinamik istisna 30 saniyeye ayarlanmıştır. Atanmamış iyonlar veya yükü 1+ ve >7+ olanlar MS/MS için reddedildi. Atanmamış iyonlar veya yükü 1+ ve >7+ olanlar MS/MS için reddedildi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Atanmamış iyonlar veya 1+ ve >7+ yüklü iyonlar MS/MS için reddedildi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ve >7+ были отклонены для МС/МС. Tanımlanmamış iyonlar veya 1+ ve >7+ yüklü iyonlar MS/MS için reddedildi.
Ham veriler, MSFragger'a dayalı FragPipe bilgi işlem platformu kullanılarak işlenir.Kütle önyargıları ve karşılık gelen amino asitler, -150 ila 500 Da'lık bir öncü kütle toleransına sahip bir açık arama algoritması kullanılarak belirlendi.Modifiye edilmiş peptitler daha sonra PD'de (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) +229.0964 ve +247.1069 Da kütle kazançları ile histidin modifikasyonları kullanılarak tanımlandı.
Kaynaşmış miniSOG genini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, 6 cm'lik tabaklara kaplandı.~%80 birleşme noktasına ulaştıktan sonra hücreler bir kez HBSS (Gibco, #14025092) ile yıkandı, daha sonra HBSS'de kimyasal problarla 37°C'de 1 saat inkübe edildi ve mavi ışıkla aydınlatıldı.Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 10W LED.PDPL'de hangi tip reaktif oksijen türlerinin yer aldığını belirlemek için 0,5 mM C vitamini (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Hücrelere takviye olarak 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 uM H2O2, 10 mM NaN3 eklendi.Soğuk PBS ile yıkandıktan sonra hücreler kazındı, 1.5 ml santrifüj tüplerinde toplandı ve EDTA'sız 1x proteaz inhibitörü (1 s ve 1 s, amplitüd %35) içeren 200 ul PBS içinde 1 dakika boyunca bir uç ile sonikasyona tabi tutuldu.Nihai karışım, 4 °C'de 10 dakika boyunca 15,871 x g'de santrifüjlendi ve süpernatan konsantrasyonu, bir BCA protein tahlil kiti kullanılarak 1 mg/mL'ye ayarlandı.Yukarıdaki lizatın yaklaşık 50 ul'si, 0.1 mM rodamin azid (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligandı ve 1 mM CuS04 ile oda sıcaklığında aşağıdan yukarıya döndürülerek 1 saat süreyle inkübe edildi.Click reaksiyonundan sonra, numunelere 250 µl önceden soğutulmuş aseton eklenerek, -20°C'de 20 dakika inkübe edilerek ve 6010xg'de 4°C'de 10 dakika santrifüj edilerek aseton ile çöktürme gerçekleştirildi.Pelet toplayın ve 95 °C'de 10 dakika boyunca 50 µl 1x Laemmli tamponunda kaynatın.Numuneler daha sonra SDS-PAGE uzun jelleri üzerinde analiz edildi ve Image Lab Touch yazılımı ile Bio-rad ChemiDoc MP Touch görüntüleme sistemi kullanılarak görselleştirildi.
Rekombinant miniSOG-6xHis proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı.Kısaca, E. coli BL21(DE3) hücreleri (TransGen, #CD701-02), pET21a-miniSOG-6xHis ile transforme edildi ve protein ekspresyonu, 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) ile indüklendi.Hücre lizizinden sonra proteinler, Ni-NTA agaroz boncukları (MCE, no. 70666) kullanılarak saflaştırıldı, PBS'ye karşı diyaliz edildi ve -80°C'de saklandı.
Antikor bazlı bir in vitro etiket yakınlık testi için, PBS'de 100 μM saflaştırılmış miniSOG, 1 mM prob 3 ve 1 μg anti-etiket fare monoklonal antikorunu (TransGen, #HT501-01) toplam 50 μl reaksiyon hacmine karıştırın..Reaksiyon karışımı, oda sıcaklığında 0, 2, 5, 10 ve 20 dakika boyunca mavi LED ışıkla ışınlandı.Karışım 0.1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligandı ve 1 mM CuS04 ile oda sıcaklığında yukarı doğru hareket eden bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle inkübe edildi.Ani bir reaksiyondan sonra, doğrudan karışıma 4x Laemmli's buffer ekleyin ve 95°C'de 10 dakika kaynatın.Numuneler SDS-PAGE jelleri üzerinde analiz edildi ve streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) ile western blotlama ile analiz edildi.
Yakınlardaki peptit bazlı in vitro etiketlemeyi analiz etmek için C-terminal amidasyonlu (LHDALDAK-CONH2) histidin içeren sentetik bir peptit kullanıldı.Bu tahlilde, 100 uM saflaştırılmış miniSOG, 10 mM prob 3 ve 2 ug/ml sentetik peptit, toplam 50 ul reaksiyon hacminde PBS içinde karıştırıldı.Reaksiyon karışımı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca mavi LED ışıkla ışınlandı.Bir mikrolitre numune, bir LC-MS sistemi (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight kütle spektrometresi ile MassLynx spektrum analiz yazılımı) kullanılarak analiz edildi.
MiniSOG füzyon genini stabil bir şekilde eksprese eden HEK293T hücreleri, farklı organel lokalizasyonuna (Mito, ER, Nucleus) sahip hatlar için 10 cm'lik tabaklara ve Parkin-miniSOG ve BRD4-miniSOG hatları için 15 cm'lik tabaklara ekildi.~%90 birleşme noktasına ulaştıktan sonra hücreler bir kez HBSS ile yıkandı, ardından prob 3 ile HBSS içinde 37°C'de 1 saat kuluçkalandı ve oda sıcaklığında 10 W mavi LED ile aydınlatıldı.Parkin'in temassız etiketlemesi için, HBSS içinde prob 3 ile 10 uM proton karbonil siyanür taşıyıcı m-klorofenilhidrazon CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C'de 1 saat boyunca eklenmiştir.Hücre lizizi, tıklama kimyası, indirgeme ve alkilasyon aşamaları, 2 mg lizat eklenmesi ve klik reaksiyonunda ışıkla bozunabilir biyotin azid yerine biyotin PEG3 azid kullanılması dışında yukarıda açıklananla aynıydı.Zenginleştirmeden sonra, boncuklar 3 kez %0.2 SDS içeren 5 ml PBS ile, 3 kez 1 M üre içeren 5 ml PBS ile ve 3 kez 5 ml PBS ile yıkandı.Daha sonra, proteini gece boyunca 37°C'de parçalamak için 1 M üre içeren 300 ul 25 mM ABC'ye 2 ug tripsin ilave edildi.Reaksiyon, 2-3 pH'a ulaşılana kadar formik asit eklenerek durduruldu.Boncuklar üzerinde tripsinizasyondan sonra, peptit çözeltisinin tuzu bir SOLAu HRP kolonu (Thermo, #60209-001) kullanılarak giderildi ve bir Speedvac vakumlu yoğunlaştırıcıda kurutuldu.Peptitler %0.1 formik asit içinde yeniden çözündürüldü ve 500 ng peptit, yukarıda açıklanan nano-ESI kaynağı ile donatılmış bir Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildi.Peptitler, her ikisi de 2 um ile doldurulmuş, ticari RP-HPLC ön sütunları (75 um x 2 cm) (Thermo, no. 164946) ve analitik RP-HPLC sütunları (75 um x 25 cm) (Thermo, no. 164941) üzerinde ayrıldı.gradyan 60 dakikada %8'den %35'e, ardından 300 Nl/dk'lık bir akış hızında lineer olarak 6 dakikada %98 B'ye yükseldi.MS spektrumları (350-1500 m/z) 60.000 çözünürlük, AGC 4 × 105 ve maksimum 50 ms giriş süresi ile toplanmıştır.Seçilen iyonlar, %30 normalize çarpışma enerjisi, 1,6 m/z dört kutuplu izolasyon penceresi ve 15000 çözünürlük ile 3 saniyelik döngülerde HCD tarafından sırayla parçalandı. 5 x 104 tandem kütle spektrometresi AGC hedefi ve maksimum enjeksiyon süresi 22 ms kullanıldı.Dinamik dışlama 45 saniyeye ayarlanmıştır. Atanmamış iyonlar veya yükü 1+ ve >7+ olanlar MS/MS için reddedildi. Atanmamış iyonlar veya yükü 1+ ve >7+ olanlar MS/MS için reddedildi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Atanmamış iyonlar veya 1+ ve >7+ yüklü iyonlar MS/MS için reddedildi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ ve >7+ были отклонены для МС/МС. Tanımlanmamış iyonlar veya 1+ ve >7+ yüklü iyonlar MS/MS için reddedildi.
NeutrAvidin boncuklarının zenginleştirilmesine kadar olan örnek hazırlama adımları, yukarıda açıklanan LC-MS/MS analizindeki ile aynıydı.Yükleme kontrolü için girdi olarak yaklaşık 50 μg lizat kullanıldı ve tıklama reaksiyonları için 2 mg lizat kullanıldı.Zenginleştirme ve nötravidin ile yıkamadan sonra, bağlı proteinler, agaroz reçine boncuklarına 50 ul Laemmli tamponu eklenerek ve 95°C'de 5 dakika kaynatılarak ayrıştırıldı.Kontrol yükü girişi ve boncukla zenginleştirilmiş numuneler SDS-PAGE ile analiz edildi ve standart Western blot yöntemleriyle PVDF membranlarına (Millipore, #ISEQ00010) aktarıldı.Zarlar, %0.1 tween-20 (TBST) içeren TBS içinde %5 yağsız süt (Sangon, #A600669) ile bloke edildi ve sırayla birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edildi.Birincil antikorlar, TBST içinde %5 yağsız süt içinde 1:1000 oranında seyreltildi ve gece boyunca 4°C'de inkübe edildi.Sekonder antikorlar 1:5000 oranında kullanıldı ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi.Membranlar, Chemidoc MP görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesans ile görselleştirildi.Şekildeki tüm kesilmemiş leke ve jel taramaları ham veri olarak sunulmaktadır.
Bu çalışmada kullanılan birincil antikorlar arasında tavşan anti-SFPQ monoklonal antikoru (CST, no. 71992), tavşan anti-FUS monoklonal antikoru (CST, no. 67840), tavşan anti-NSUN2 poliklonal antikoru (Proteintech, no. 20854-1-) bulunmaktadır. AP), tavşan anti-mSin3A poliklonal antikoru (Abcam, #ab3479), fare anti-etiket monoklonal antikoru (TransGen, #HT201-02), fare anti-β-aktin monoklonal antikoru (TransGen, #HC201-01), tavşan anti -CDK2 monoklonal antikoru (ABklonal, #A0094), CTBP1'e tavşan monoklonal antikoru (ABklonal, #A11600), DUT'a tavşan poliklonal antikoru (ABklonal, #A2901), PSMC4'e tavşan poliklonal antikoru (ABklonal, #A2505), tavşan anti- DNAJB1 poliklonal antikoru (ABklonal, # A5504).Bu antikorlar, TBST'de %5 yağsız sütte 1:1000 seyreltmede kullanıldı.Bu çalışmada kullanılan ikincil antikorlar, 1:5000 dilüsyonda anti-tavşan IgG (TransGen, #HS101-01), anti-fare IgG (TransGen, #HS201-01) içermektedir.
BRD4'ün SFPQ ile etkileşime girip girmediğini daha fazla araştırmak için, HEK293T'yi aşırı eksprese eden stabil HEK293T ve BRD4-miniSOG hücreleri 10 cm'lik tabaklara kaplandı.Hücreler, soğuk PBS ile yıkandı ve 4°C'de 30 dakika boyunca EDTA içermeyen proteaz inhibitörü ile 1 ml Pierce IP liziz tamponu (Thermo Fisher, #87787) içinde parçalandı.Bundan sonra, lizatlar 1.5 ml'lik santrifüj tüplerinde toplandı ve 4°C'de 10 dakika boyunca 15.871 x g'de santrifüjlendi.Süpernatan toplandı ve 5 ug anti-V5 etiketli fare monoklonal antikoru (CST, #80076) ile gece boyunca 4°C'de inkübe edildi.Yaklaşık 50 µl protein A/G manyetik boncuklarını (MCE, #HY-K0202) %0.5 Tween-20 içeren PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra hücre lizatları 4 saat boyunca 4°C'de alttan üste döndürülerek manyetik boncuklarla inkübe edildi.Daha sonra boncuklar 1 ml PBST tamponu ile dört kez yıkandı ve 95°C'de 5 dakika kaynatıldı.Numuneler, SDS-PAGE jelleri üzerinde analiz edildi ve standart Western blot yöntemleri kullanılarak PVDF membranlarına aktarıldı.Membranlar, TBST'de %5 yağsız süt içinde bloke edildi ve sırayla birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edildi.Birincil Antikor Tavşan anti-SFPQ monoklonal antikoru (CST, #71992) TBST içinde %5 yağsız süt içinde 1:1000 oranında kullanıldı ve gece boyunca 4°C'de inkübe edildi.1:5000 oranında anti-tavşan IgG kullanıldı ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi.Membranlar, Chemidoc MP görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesans ile görselleştirildi.
Çözücü Erişilebilir Yüzey Alanı (SASA) analizi için kullanılan tüm yapılar, Protein Veri Bankasından (PDB)52 veya AlphaFold Protein Yapısı Veritabanından53 elde edildi.Mutlak SASA, FreeSASA programı kullanılarak her kalıntı için hesaplandı.Her yapı için ortalama SASA'yı elde etmek için yalnızca etiketli histidin ve komşuları için tam ve net SASA verileri kullanıldı.Her histidin için bağıl çözücü erişilebilirliği (RSA), mutlak SASA değerinin çözücü için mevcut olan ampirik maksimum olası kalıntı yüzey alanına bölünmesiyle hesaplandı.Daha sonra, ortalama RSA %20'nin altındaysa tüm histidinler gizli olarak sınıflandırıldı, aksi takdirde açığa çıktı56.
DDA modunda elde edilen ham dosyalar, ortak kirleticileri içeren uygun SwissProt doğrulanmış protein veritabanında Proteome Discoverer (v2.5) veya MSfragger (Fragpipe v15.0) kullanılarak arandı.Peptitler, iki eksik bölünme bölgesi olan tam tripsin, sabit bir modifikasyon olarak karbamoil metilasyon ve dinamik bir modifikasyon olarak metiyonin oksidasyonu gerektiriyordu.Öncü ve parça ağırlık toleransları sırasıyla 10 ppm ve 0.02 Da'ya (MS2 Orbitrap) ayarlandı. Kirletici isabetler çıkarıldı ve proteinler, <%1'lik bir yanlış keşif oranı elde etmek için filtrelendi. Kirletici isabetler çıkarıldı ve proteinler, <%1'lik bir yanlış keşif oranı elde etmek için filtrelendi. загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэнофициент лодогент ложу.1% Kirletici isabetler kaldırıldı ve proteinler, <%1'lik bir yanlış saptama oranı verecek şekilde filtrelendi.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровняющих веществ были удалены, а белки для достижения уровня ложных нобнар. Kirletici isabetler kaldırıldı ve proteinler, <%1'lik bir yanlış pozitif oranı elde etmek için filtrelendi.Etiketler kullanılmadan nicel analiz için, üç biyolojik tekrardan normalleştirilmiş protein içeriği kullanıldı.Protein hücre altı lokalizasyon analizi, DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0'dan Gene Ontology (GO) analizi ve Alice Ting grubu tarafından derlenen ve yayınlanan veri tabanları kullanılarak yapıldı.Volkan haritası Perseus'tan (v1.6.15.0) elde edildi. Protein bolluğu kat değişiklikleri, iki taraflı bir t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından test edildi ve protein isabetleri, >2 bolluk değişikliği (aksi belirtilmedikçe) ve p değeri <0.05 ile tanımlandı. Protein bolluğu kat değişiklikleri, iki taraflı bir t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından test edildi ve protein isabetleri, >2 bolluk değişikliği (aksi belirtilmedikçe) ve p değeri <0.05 ile tanımlandı. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Protein içeriği kat değişiklikleri, iki kuyruklu bir t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından test edildi ve protein eşleşmeleri, içerik değişikliği >2 (aksi belirtilmedikçe) ve p değeri <0.05 ile tanımlandı.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Protein içeriğindeki kat değişikliklerinin istatistiksel önemi, iki kuyruklu bir t-testi kullanılarak test edildi ve içerik değişiklikleri >2 (aksi belirtilmedikçe) ve p-değerleri <0.05 için protein eşleşmeleri belirlendi.Protein etkileşim analizi, String veri tabanı ile birlikte GO analizi kullanılarak yapıldı.
Benzer sonuçlarla üç biyolojik kopya gerçekleştirildi.İstatistiksel analiz GraphPad Prism (GraphPad yazılımı) ile yapıldı ve Perseus (v1.6.15.0) ile volkan grafikleri oluşturuldu.İki grubu karşılaştırmak için iki kuyruklu Student t testi kullanılarak p değerleri belirlendi.Volkan parsellerine sadece deney grubunda en az iki kez tanımlanan tekil proteinler dahil edilmiş ve kontrol grubunda karşılık gelen eksik değerler, p değerinin hesaplanabilmesi için normal bir dağılımdan Perseus ile değiştirilmiştir.Hata çubukları, ortalama ± standart sapmayı temsil eder.İstatistiksel analiz için proteomik analizlerde, en az iki biyolojik kopyada ortaya çıkan proteinlerin bolluğu korunmuştur.Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için istatistiksel yöntemler kullanılmamıştır.Deneyler rastgele değildir.Araştırmacılar, deney ve sonuçların değerlendirilmesi sırasında görevlere kör değildi.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, bu makaleyle bağlantılı Doğa Araştırma Raporu özetine bakın.
Bu çalışmada elde edilen kütle spektrometrisi verileri, veri kümesi ID PXD034811 (PDPL-MS veri kümesi) altında iProX57 ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na sunuldu.Ham veriler, ham veri dosyaları şeklinde sağlanır.Bu makale orijinal verileri sağlar.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Komşuluğu tanımak: protein komplekslerini karakterize etmek ve organelleri haritalamak için yakınlığa bağlı biyotinilasyonu kullanmak. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Komşuluğu tanımak: protein komplekslerini karakterize etmek ve organelleri haritalamak için yakınlığa bağlı biyotinilasyonu kullanmak.Gingras, AS, Abe, KT ve Raut, B. Çevreye aşinalık: protein komplekslerini karakterize etmek ve organelleri haritalamak için yakınlığa bağlı biyotinilasyonu kullanma. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Mahalleyi anlamak: mahallenin biyolojik yaşama bağımlılığını kullanın.Gingras, AS, Abe, KT ve Raut, B. Yakınlığı anlama: protein komplekslerinin karakterizasyonu ve yakınlığa bağlı biyotinilasyon kullanılarak organellerin haritalanması.Akım.Benim fikrim.Kimyasal.biyoloji 48, 44-54 (2019).
Geri, JB ve ark.Dexter enerjisini bağışıklık hücrelerine aktararak mikro çevrenin haritasını çıkarmak.Bilim 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL ve ark.İki proteom ölçekli ağlar, insan interaktomunun hücreye özgü yeniden şekillenmesini tespit eder.Hücreler 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Gönderim zamanı: Eylül-15-2022
