Haberler

Bulaşıcı hastalıkları tespit etmek için geleneksel teşhis stratejileri, bakım noktası testi (POCT) için uygun olmayan tezgah üstü aletlerin kullanılmasını gerektirir.Gelişmekte olan mikroakışkanlar, hızlı, düşük maliyetli, doğru yerinde teşhis için geleneksel yöntemlere potansiyel bir alternatif olan oldukça minyatürleştirilmiş, otomatikleştirilmiş ve entegre bir teknolojidir.Moleküler tanı yöntemleri, patojen tespiti için en etkili yöntemler olarak mikroakışkan cihazlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.Bu derleme, bulaşıcı hastalıkların mikroakışkan tabanlı moleküler teşhisindeki son gelişmeleri hem akademik hem de endüstriyel bir bakış açısıyla özetlemektedir.İlk olarak, numune ön işlemi, amplifikasyon ve sinyal okuma dahil olmak üzere nükleik asitlerin tipik bir çip üzerinde işlenmesini açıklıyoruz.Dört tip mikroakışkan platformun özellikleri, avantajları ve dezavantajları daha sonra karşılaştırılır.Daha sonra, nükleik asitlerin mutlak miktar tayini için dijital tahlillerin kullanımını tartışacağız.Hem klasik hem de yeni ticari mikroakışkan tabanlı moleküler tanı cihazları, pazarın mevcut durumunun kanıtı olarak özetlenmiştir.Son olarak, bulaşıcı hastalıkların mikroakışkan teşhisi için gelecekteki yönergeleri öneriyoruz.
Bulaşıcı hastalıklara bakteri, virüs ve parazitler dahil olmak üzere tüm dünyaya dağılmış patojenler neden olur.Diğer hastalıklardan farklı olarak, patojenler hızla enfekte olur ve inokülasyon, hava ve su ortamı yoluyla insanlar ve ev sahibi hayvanlar arasında yayılır [1].Bulaşıcı hastalıkların önlenmesi bir halk sağlığı önlemi olarak kritik öneme sahiptir.Bulaşıcı hastalıklarla mücadele için üç ana strateji: (1) enfeksiyon kaynağını kontrol etmek;(2) iletim yolunun kesilmesi;(3) duyarlı popülasyonların korunması.Ana stratejiler arasında enfeksiyon kaynağının kontrolü, uygunluğu ve düşük maliyeti nedeniyle en önemli strateji olarak kabul edilmektedir.Enfekte bireylerin hızlı teşhisi, izolasyonu ve tedavisi kritik öneme sahiptir ve hızlı, hassas ve doğru teşhis stratejileri gerektirir [2].Bulaşıcı hastalıkların mevcut teşhisi genellikle belirti ve semptomlara dayalı klinik muayene ile hücre kültürü ve moleküler teşhis gibi eğitimli personel, emek yoğun prosedürler ve pahalı test ekipmanı gerektiren laboratuvar çalışmalarını birleştirir [3, 4].Bulaşıcı hastalık salgınlarının önlenmesi, özellikle bulaşıcı hastalıkların yaygın ve şiddetli olduğu sınırlı kaynaklarda [5] hızlı, ucuz ve doğru yerel teşhisin yanı sıra acil durumların öngörülemez olduğu vahşi doğada veya savaş alanında tedavi gerektirir..tıbbi bakım sınırlıdır [6].Bu bağlamda mikroakışkanlar, hassas sıvı manipülasyonu [7,8,9,10] için mikroelektromekanik sistem teknolojilerini, nanoteknolojiyi veya malzeme bilimini birleştiren ve bakım noktası tespiti (POCT) için yeni olanaklar sağlayan bir teknolojidir.) hastaneler ve laboratuvarlar dışındaki bulaşıcı ajanlar.Geleneksel zaman alıcı tanılama ile karşılaştırıldığında, mikroakışkan teknolojisi, hastalık salgınları sırasında moleküler tanılama için numune ve maliyet tasarrufu sağlar.Koronavirüs hastalığı 2019'un (COVID-19) küresel yayılmasına şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) neden olur, bu nedenle pandeminin zamanında önlenmesi ve kontrolü için mikroakışkanların önemi bir kez daha vurgulanmaktadır [11, 12 , 13].Geleneksel tanılamanın aksine, mikroakışkan POCT, örnekleme noktasının yakınında test yapmak için masaüstü analizörlerden küçük yan akış test şeritlerine kadar küçük taşınabilir cihazlar kullanır [14].Bu testler, basit veya hiç örnek hazırlama, hızlı sinyal amplifikasyonu ve hassas sinyal okumaları ile kısa sürede ve dakikalar içinde doğru sonuçlar verir.Mikroakışkan tabanlı sağlık cihazlarının mevcudiyeti ve seri üretimi, maliyet etkin ve doğrudan teşhis uygulamalarını hastane dışında, hastanın yakınında ve hatta evde genişletmiştir.
Bulaşıcı hastalıkları teşhis etmek için mevcut stratejiler arasında moleküler teşhis en hassas olanlardan biridir [15, 16].Ek olarak, moleküler tanı genellikle COVID-19'un sürekli tespiti için altın standart olarak kullanılır ve bir bağışıklık tepkisinin başlangıcından önce virüse özgü RNA veya DNA bölgelerinin doğrudan tespitine izin verir [17, 18].Bu derlemede, bulaşıcı hastalıklar için mikroakışkan tabanlı moleküler tanı süreçlerindeki en son gelişmeleri akademik bir perspektiften gelecekteki endüstriyel perspektiflere kadar sunuyoruz (Şekil 1).Nükleik asit saptamada üç temel adımla başlayacağız: çip üzerinde numune ön işlemi, nükleik asit amplifikasyonu ve sinyal okuma.Daha sonra, benzersiz özellikler (güçlü ve zayıf yönler) gösteren farklı mikroakışkan platform türlerini yapıları ve işlevleriyle karşılaştırdık.Dijital nükleik asit tespiti ayrıca tartışılmakta ve bulaşıcı patojen moleküllerinin mutlak ölçümü için üçüncü nesil bir teknolojinin bir örneği olarak verilmektedir.Ek olarak, moleküler teşhis için mikroakışkan POCT pazarının mevcut durumunu göstermek için birkaç tipik ve en yeni ticari POCT cihazı sunulacaktır.Ayrıca gelecekteki uygulamalar için vizyonumuzu tartışacağız ve açıklayacağız.
Nükleik asit tespiti için mikroakışkan çip modülleri, işlevlerine göre üç kategoriye (örnekleme, tanıma ve sinyalleme) ayrılabilir [19].Bu modüller arasında, numune alma modülü esas olarak numune lizizini ve nükleik asit ekstraksiyonunu gerçekleştirir.Sensör modülü esas olarak nükleik asit sinyallerinin dönüşümünü ve amplifikasyonunu kontrol eder.Sinyal modülü, algılama modülü tarafından dönüştürülen ve işlenen sinyali algılar.Bir çip üzerindeki nükleik asitleri tespit etme sürecine dayanarak, “giriş ve çıkış” işlevini gerçekleştirebilen çeşitli çipleri özetleyeceğiz.
Nükleik asit tespitinde ilk adım, nükleik asit ekstraksiyonu, yani hedef nükleik asidi orijinal numuneden izole etmektir.Nükleik asit ekstraksiyonu, nükleik asitleri diğer moleküler kirleticilerden arındırmak, nükleik asit moleküllerinin birincil yapısının bütünlüğünü sağlamak ve sonuçları optimize etmek için gerçekleştirilir.Nükleik asit ekstraksiyonu, kalitesi ve verimliliği araştırma ve teşhis sonuçları üzerinde büyük etkisi olan gerekli numune lizizi ve nükleik asit yakalamayı gerektirir.Ekstraksiyon sırasında herhangi bir ince yan etki, daha fazla algılamayı sınırlayabilir.Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve döngü izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemleri, nükleik asit izolasyon reaktiflerinde etanol ve izopropanol gibi bazı kalıntı organik çözücüler tarafından inhibe edilir [20].Sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve katı faz ekstraksiyonu, nükleik asitleri izole etmek için en popüler yöntemlerdir [21], ancak bir çip üzerinde sıvı-sıvı ekstraksiyonu son derece sınırlıdır, çünkü sıvı-sıvı ekstraksiyonunda kullanılan reaktifler çoğu mikroakışkan çipin korozyonuna neden olur. .Burada, mikrodizi tabanlı katı faz ekstraksiyon yöntemlerini vurguluyor ve avantajlarını ve dezavantajlarını karşılaştırıyoruz.
Silikon, biyouyumluluğu, stabilitesi ve modifikasyon kolaylığı nedeniyle nükleik asitlerle uyumlu bir substrat materyalidir [22].Önemli olarak, silika veya diğer malzemelerle modifiye edildiğinde, bu kompozit, negatif yüklü nükleik asitleri düşük pH, yüksek tuz koşulları altında yüksek pH, düşük tuz çözeltileri ile ayrıştırırken adsorbe etme özellikleri sergiler.Bu fenomene dayanarak, nükleik asidi saflaştırmak mümkündür.
Silika boncuklar, tozlar, mikrofiber filtreler ve silika membranlar gibi mikroakışkanlarda nükleik asit ekstraksiyonu için çeşitli silika bazlı materyaller kullanılmıştır [23, 24, 25, 26].Malzemenin özelliklerine bağlı olarak silikon bazlı malzemeler mikro devrelerde farklı şekillerde kullanılabilir.Örneğin, silika granülleri, tozlar ve ticari nanofiltreler mikroakışkan çiplerin gözeneklerine veya mikro kanallarına basitçe yerleştirilebilir ve numunelerden nükleik asitlerin çıkarılmasına yardımcı olabilir [27, 28, 29].Yüzeyi değiştirilmiş silika membranlar, DNA'yı patojenlerden düşük maliyetle hızla saflaştırmak için de kullanılabilir.Örneğin, Wang ve ark.[30] Denatüre edici amplifikasyon reaksiyonlarını vezikül aracılı zincir değişimi ile kitosan oligosakkaritler ile kaplanmış silika membranlar ile birleştirerek, 102-108 koloni oluşturan birimi başarıyla tespit eden çok yönlü bir taşınabilir sistem tanıtıldı.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.ve virüsün varlığı kolayca görülebiliyordu.Powell et al.[31] Daha sonra, hepatit C virüsünü (HCV), insan immün yetmezlik virüsünü (HIV), Zika virüsünü ve insan papilloma virüsünü ve RNA virüslerini yakalamak için 1.3 µl kıvrımlı bir mikroreaktörün geliştirildiği otomatik yayılmayı tespit etmek için silikon bazlı mikrodiziler kullanıldı.ve yerinde amplifikasyon gerçekleştirin.Bu yöntemlere ek olarak, yüzeyi modifiye edilmiş silika mikro kolonları, modifiye edici materyalin geometrisi ve özellikleri ekstraksiyon verimliliğini büyük ölçüde arttırdığından, nükleik asit ekstraksiyonunda da önemli bir rol oynar.Chen et al.[32], amino kaplı silikon mikrokolonlara dayalı düşük konsantrasyonlu RNA'nın izolasyonu için bir mikroakışkan platform önerdi.Bu mikroakışkan cihaz, yüksek yüzey alanı-hacim oranı tasarımı ile daha yüksek ekstraksiyon verimliliği elde etmek için bir silikon substrat üzerinde bir dizi 0.25 cm2 mikro sütunu birleştirir.Bu tasarımın avantajı, mikroakışkan cihazın %95'e kadar nükleik asit ekstraksiyon verimliliği elde edebilmesidir.Bu silikon bazlı stratejiler, düşük maliyetle hızla izole edilen nükleik asitlerin değerini göstermektedir.Mikroakışkan çiplerle kombinasyon halinde, silikon bazlı ekstraksiyon stratejileri sadece nükleik asit tespitinin etkinliğini arttırmakla kalmaz, aynı zamanda analitik cihazların minyatürleştirilmesini ve entegrasyonunu da kolaylaştırır [20].
Manyetik ayırma yöntemleri, harici bir manyetik alan varlığında nükleik asitleri izole etmek için manyetik parçacıkları kullanır.Yaygın olarak kullanılan manyetik parçacıklar, silika, amino ve karboksil ile kaplanmış Fe3O4 veya γ-Fe2O3 manyetik parçacıkları içerir [33,34,35,36].Manyetik parçacıkların silikon bazlı SPE yöntemlerine göre ayırt edici özelliği, harici mıknatıslarla manipülasyon ve kontrol kolaylığıdır.
Nükleik asitler ve silika arasındaki elektrostatik etkileşimi kullanarak, yüksek tuz ve düşük pH koşulları altında, nükleik asitler silika kaplı manyetik parçacıkların yüzeyinde adsorbe edilirken, düşük tuz ve yüksek pH koşulları altında moleküller yıkanabilir. Yeniden..Silika kaplı manyetik boncuklar, manyetik kontrollü hareket kullanarak büyük hacimli numunelerden (400 μL) DNA çıkarmayı mümkün kılar [37].Bir gösteri olarak, Rodriguez-Mateos ve ark.[38], manyetik boncukların farklı bölmelere transferini kontrol etmek için ayarlanabilir mıknatıslar kullandı.Silika kaplı manyetik partiküllere dayalı olarak, LAMP ters transkripsiyon tespiti (RT-LAMP) için atık su örneklerinden 470 kopya/mL SARS-CoV-2 genomik RNA ekstrakte edilebilir ve yanıt 1 saat içinde okunabilir.çıplak göz (Şekil 2a).
Manyetik ve gözenekli malzemelere dayalı cihazlar.SARS-CoV-2 RNA tespiti için IFAST RT-LAMP mikroakışkan cihazının kavramsal diyagramı ([38]'den uyarlanmıştır).b Bukkal sürüntü nükleik asidinin dSPE'si için santrifüjlü mikro cihaz ([39]'dan uyarlanmıştır).c Bir FTA® kartı ([50]'den uyarlanmıştır) kullanan yerleşik, kendi kendine güç sağlayan örnek yoğunlaştırıcı.d Kitosan ile modifiye edilmiş Fusion 5 filtre kağıdı ([51]'den uyarlanmıştır).SARS-CoV-2 şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2, RT-LAMP ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon, FTA bulucu teknoloji ortakları, NA nükleik asit
Pozitif yüklü manyetik parçacıklar, bir nükleik asidin fosfat omurgasını bağlamak için idealdir.Belirli bir tuz konsantrasyonunda, nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat grupları, manyetik kompozit parçacıkların yüzeyinde pozitif olarak yüklenebilir.Bu nedenle, nükleik asitlerin ekstraksiyonu için pürüzlü bir yüzeye ve yüksek yoğunluklu amino gruplarına sahip manyetik nanopartiküller geliştirilmiştir.Manyetik ayırma ve bloklamadan sonra, manyetik nanopartiküller ve DNA kompleksleri, karmaşık ve zaman alıcı saflaştırma ve elüsyon işlemleri ihtiyacını ortadan kaldıran PCR'de doğrudan kullanılabilir [35].Negatif karboksil gruplarıyla kaplanmış manyetik nanopartiküller, yüksek konsantrasyonlu polietilen glikol ve sodyum klorür çözeltilerinde yüzeylere adsorbe edilen nükleik asitleri ayırmak için de kullanılmıştır [36].Bu yüzeyi modifiye edilmiş manyetik boncuklar ile DNA ekstraksiyonu, sonraki amplifikasyon ile uyumludur.Dignan et al.[39], nükleik asit ön işlemesi için teknik olmayan personelin yerinde kullanmasına izin veren otomatik ve taşınabilir bir santrifüj mikroakışkan platformu tanımladı.Ek olarak, izole edilmiş DNA'nın, bakım noktası nükleik asit analizi için çok uygun bir yöntem olan LAMP ile uyumluluğu, ayrıca minimum ekipman gereksinimlerini ve kolorimetrik deneyler için uygunluğu gösterir (Şekil 2b).
Manyetik boncuk yöntemleri, bazıları ticari otomatikleştirilmiş nükleik asit ekstraktörlerinde [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ABD), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekin, Çin) ve Biomek®;Beckman (Miami, ABD).), Florida, ABD)].Manyetik boncukları mikroakışkanlarla birleştirmenin avantajları, potansiyel olarak moleküler teşhisin gelişimini ilerletebilecek nükleik asitlerin verimli otomatik ekstraksiyonu için kullanılabilir;bununla birlikte, manyetik boncukların mikroakışkanlarla kombinasyonu, manyetik boncukların hassas manipülasyonu için hala büyük ölçüde karmaşık kontrol sistemlerine dayanmaktadır; bu, ticari ürünlerin hantal ve pahalı olmasının popülaritesini açıklar, bu da POCT'de manyetik boncukların daha fazla uygulanmasını sınırlar.
Modifiye edilmiş nitroselüloz filtreler, Finders Technology Associates (FTA) kartları, polietersülfon bazlı filtre kağıtları ve glikan kaplı malzemeler gibi çeşitli gözenekli malzemeler de nükleik asit tespiti için kullanılmıştır [40, 41, 42, 43, 44].Lifli kağıt gibi gözenekli lifli malzemeler ilk olarak uzun iplikli DNA moleküllerini liflerle fiziksel olarak dolaştırarak DNA'yı izole etmek için kullanıldı.Küçük gözenekler, DNA ekstraksiyonunu olumlu yönde etkileyen DNA moleküllerinin güçlü bir fiziksel kısıtlamasına yol açar.Lifli kağıdın farklı gözenek boyutları nedeniyle, ekstraksiyon verimliliği DNA amplifikasyonunun ihtiyaçlarını karşılayamaz [45, 46].FTA kartı, adli tıp alanında kullanılan ve moleküler teşhisin diğer alanlarında yaygın olarak kullanılan ticari bir filtre kağıdıdır.Numunedeki hücre zarlarını parçalamak için çeşitli kimyasallarla emprenye edilmiş selüloz filtre kağıdı kullanılarak, açığa çıkan DNA 2 yıla kadar bozulmadan korunur.Daha yakın zamanlarda, SARS-CoV-2, leishmaniasis ve sıtma dahil olmak üzere çeşitli patojenlerin moleküler tespiti için emdirilmiş selüloz kağıdı geliştirilmiştir [47,48,49].İzole edilmiş plazmadaki HIV doğrudan parçalanır ve viral nükleik asit, yoğunlaştırıcıya yerleştirilmiş FTA® akış zarında zenginleştirilir, bu da nükleik asidin verimli üretimine olanak tanır [50] (Şekil 2c).FTA kartları kullanılarak nükleik asit tespiti ile ilgili temel problem, guanidin ve izopropanol gibi kimyasalların müteakip amplifikasyon reaksiyonlarını engellemesidir.Bu sorunu çözmek için, yüksek verimli nükleik asit ekstraksiyonu elde etmek için hem DNA moleküllerinin fiziksel olarak birbirine geçmesinin hem de lifli filtre kağıdının avantajlarını ve kitosan ile modifiye edilmiş bileşikler üzerinde DNA'nın elektrostatik adsorpsiyonunun avantajlarını birleştiren Fusion 5 kitosan ile modifiye edilmiş filtre kağıdını geliştirdik. ..filtre lifleri [51] (Şekil 2d).Benzer şekilde, Zhu ve ark.[52], Zika virüsü RNA'sının hızlı izolasyonu ve tespiti için bir yerinde kapiler mikroakışkan sisteme dayalı kitosan ile modifiye edilmiş bir PCR yöntemini gösterdi.Nükleik asitler, kitosanın açma/kapama anahtarı özelliğine bağlı olarak, sırasıyla karışık bir lizat/PCR ortamında adsorbe edilebilir/desorbe edilebilir.açık ve kapalı”, pH'a duyarlı.
Yukarıda bahsedildiği gibi, bu stratejiler, çeşitli katı fazlı malzemelerin avantajlarını birleştirir ve mikroakışkanlarda nükleik asit ekstraksiyonunun verimliliğini arttırır.Pratik uygulamalarda, bu malzemelerin büyük miktarlarda kullanılması ekonomik değildir ve uygun yüzey işlemi veya yaygın malzemelerin bu malzemelerle yüzey modifikasyonu da işlevlerini koruyabilir.Bu nedenle, bu stratejilerin bir pilot çalışma sonrasında uygulanmasının maliyetleri azaltabileceğine inanılmaktadır.
Mikroakışkan platformlarda nükleik asit testi genellikle küçük numune hacimleri (< 100 µl) kullanır, bu nedenle hedef nükleik asitlerin, aşağı akış tespiti (optik, elektrik ve manyetik) için uygun bir sinyale dönüştürülmesi için spesifik problarla amplifikasyonunu gerektirir [53, 54]. Mikroakışkan platformlarda nükleik asit testi genellikle küçük numune hacimleri (< 100 µl) kullanır, bu nedenle hedef nükleik asitlerin, aşağı akış tespiti (optik, elektrik ve manyetik) için uygun bir sinyale dönüştürülmesi için spesifik problarla amplifikasyonunu gerektirir [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Mikroakışkan platformlarda nükleik asitleri test ederken, genellikle küçük numune hacimleri (<100 µL) kullanılır, bu nedenle sonraki tespit (optik, elektrik ve manyetik) için uygun bir sinyale dönüştürmek için hedef nükleik asitlerin özel problarla amplifikasyonu gerekir. [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 ， 以 转换 为 下游 下游 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Mikroakışkan platformlarda nükleik asitlerin tespiti genellikle küçük numune hacimleri (<100 µl) kullanır, bu da hedef nükleik asitlerin sonraki tespit (optik, elektrik ve manyetik) için sinyallere dönüştürülmesi için özel problarla amplifikasyonunu gerektirir [53, 54]] .Mikroakışkanlarda nükleik asit amplifikasyonu ayrıca reaksiyonları hızlandırabilir, tespit limitlerini optimize edebilir, numune gereksinimlerini azaltabilir ve tespit doğruluğunu iyileştirebilir [55, 56].Son yıllarda hızlı ve doğru tespitin gerçekleştirilmesi ile mikroakışkanlarda PCR ve bazı izotermal amplifikasyon reaksiyonları dahil olmak üzere çeşitli nükleik asit amplifikasyon yöntemleri uygulanmaktadır.Bu bölüm, mikroakışkan sistemlere dayalı nükleik asit saptama yöntemlerini özetleyecektir.
PCR, teorisi başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan ve burada tartışılmayacak olan bir organizmanın DNA replikasyon sürecinin bir simülasyonudur.PCR, çok az miktarda hedef DNA/RNA'yı üstel bir oranda çoğaltabilir, bu da PCR'yi nükleik asitlerin hızlı tespiti için güçlü bir araç haline getirir.Son yıllarda, PCR termal döngü sistemleri ile donatılmış birçok taşınabilir mikroakışkan cihaz, bakım noktası teşhisinin ihtiyaçlarını karşılamak için geliştirilmiştir [57, 58].On-chip PCR, farklı sıcaklık kontrol yöntemlerine göre dört tipe (geleneksel, sürekli akış, uzamsal olarak anahtarlanmış ve konvektif PCR) ayrılabilir [59].Örneğin, Gee ve ark.[60], boğaz sürüntü örneklerinde SARS-CoV-2, influenza A ve B virüslerinin multipleks tespiti için kendi mikroakışkan platformlarında doğrudan bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemi geliştirdi (Şekil 3a).Park et al.[61] ince film PCR, elektrotlar ve parmakla çalışan polidimetilsiloksan bazlı mikroakışkan modülü entegre ederek basit bir patojen analiz çipi oluşturdu.Bununla birlikte, her iki çalışma da geleneksel PCR'nin ortak eksikliklerini içermektedir.PCR, daha fazla cihaz minyatürleştirmesini ve azaltılmış test süresini sınırlayan termal döngü gerektirir.
Sürekli akış tabanlı mikroakışkan ve boşluk anahtarlamalı PCR'nin geliştirilmesi, bu sorunu ele almak için kritik öneme sahiptir.Uzun bir serpantin kanalı veya kısa bir düz kanal kullanan sürekli akışlı PCR, reaktifleri çipsiz bir pompa ile üç ön ısıtma bölgesinde aktif olarak dolaştırarak hızlı amplifikasyon sağlayabilir.Bu işlem, farklı reaksiyon sıcaklıkları arasındaki geçiş fazını başarılı bir şekilde önler ve böylece test süresini önemli ölçüde azaltır [62] (Şekil 3b).Jung ve ark.[63], ultra hızlı ve multipleks ters transkripsiyon PCR için sabit ve akışlı PCR'nin özelliklerini birleştiren yeni bir döner PCR genetik analizörü önerdi (Şekil 3c).Nükleik asit amplifikasyonu için, PCR mikroçipi farklı sıcaklıklarda üç ısıtma bloğu boyunca döndürülecektir: 1. Denatürasyon bloğu 94°C, 2. Tavlama bloğu 58°C'de, 3. Genişleme bloğu 72°C'de.
Mikroakışkanlarda PCR uygulaması.Mikroakışkan bir platformda dirRT-qPCR'nin şematik gösterimi ([60]'dan uyarlanmıştır).b Bir serpantin kanalına dayalı sürekli akışlı bir PCR mikrodizisinin şematik gösterimi ([62]'den uyarlanmıştır).c Bir mikroçip, üç ısıtma bloğu ve bir kademeli motordan oluşan döner bir PCR genetik analizörünün şematik gösterimi ([63]'ten uyarlanmıştır).d Santrifüjleme ve kurulum ile termokonveksiyon PCR diyagramı ([64]'ten uyarlanmıştır).DirRT-qPCR, doğrudan kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu
Kılcal damarlar ve halkalar ve hatta ince plakalar kullanan konveksiyon PCR, harici bir pompaya ihtiyaç duymadan doğal serbest termal konveksiyon yoluyla nükleik asitleri hızla çoğaltabilir.Örneğin, bir PCR döngü mikrokanalında [64] (Şekil 3d) santrifüjleme ile termal döngü kullanan fabrikasyon bir döner ısıtma aşaması üzerinde bir döngüsel olefin polimer mikroakışkan platformu geliştirilmiştir.Reaksiyon çözeltisi, dairesel bir yapıya sahip bir mikrokanalda sürekli olarak yüksek ve düşük sıcaklık alışverişi yapan termal konveksiyon tarafından tahrik edilir.Tüm amplifikasyon işlemi, 70,5 pg/kanal algılama limiti ile 10 dakikada tamamlanabilir.
Beklendiği gibi, hızlı PCR, tam entegre numune yanıtlı moleküler tanı ve multipleks analiz sistemleri için güçlü bir araçtır.Rapid PCR, COVID-19 pandemisinin etkin kontrolüne katkıda bulunan SARS-CoV-2'yi tespit etmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır.
PCR, POCT için uygun olmayan karmaşık bir termal döngüleyici gerektirir.Daha yakın zamanlarda, izotermal amplifikasyon teknikleri, LAMP, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve nükleik asit dizilerine dayalı amplifikasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere mikroakışkanlara uygulanmıştır [65,66,67,68].Bu tekniklerle, nükleik asitler sabit bir sıcaklıkta amplifiye edilir ve moleküler teşhis için düşük maliyetli, oldukça hassas portatif POCT cihazlarının oluşturulmasını kolaylaştırır.
Yüksek verimli mikroakışkan bazlı LAMP tahlilleri, bulaşıcı hastalıkların çoklu tespitine izin verir [42, 69, 70, 71].Bir santrifüj mikroakışkan sistemi ile birlikte LAMP, nükleik asit tespitinin otomasyonunu daha da kolaylaştırabilir [69, 72, 73, 74, 75].Döndür ve tepki ver SlipChip, LAMP [76] (Şekil 4a) kullanılarak çok sayıda paralel bakterinin görsel tespiti için geliştirilmiştir.Testte optimize edilmiş LAMP kullanıldığında, floresan sinyal-gürültü oranı yaklaşık 5 kat olmuştur ve saptama sınırı 7,2 kopya/µl genomik DNA'ya ulaşmıştır. Ayrıca, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ve Vibrio parahaemolyticus dahil olmak üzere beş yaygın sindirim bakteriyel patojeninin varlığı, yönteme göre < 60 dakika içinde görselleştirildi. Ayrıca, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ve Vibrio parahaemolyticus dahil olmak üzere beş yaygın sindirim bakteriyel patojeninin varlığı, yönteme göre < 60 dakika içinde görselleştirildi.Ayrıca, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ve Vibrio parahaemolyticus dahil olmak üzere sindirim sisteminde yaygın olarak bulunan beş bakteriyel patojenin varlığı 60 dakikadan daha kısa bir sürede bu yöntemle görüntülendi.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 五 种 常见 消化道 的 ， ， 包括 、 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPEk olarak, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius ve Vibrio parahaemolyticus dahil olmak üzere beş yaygın bakteriyel gastrointestinal patojenin varlığı, bu yöntem kullanılarak 60 dakikadan daha kısa bir sürede görüntülendi.
LAMP'nin mikroakışkanlardaki avantajları arasında, diğerlerinin yanı sıra hızlı tepki ve minyatür algılama bulunur.Bununla birlikte, reaksiyon sıcaklığı (yaklaşık 70°C) nedeniyle, LAMP sırasında kaçınılmaz olarak aerosoller üretilir ve bu da yüksek bir yanlış pozitif oran ile sonuçlanır.Test özgüllüğü, primer tasarımı ve sıcaklık kontrolünün de LAMP için optimize edilmesi gerekir.Ayrıca, tek bir çip üzerinde çoklu hedef tespiti uygulayan çip tasarımları çok değerlidir ve geliştirilmelidir.Ek olarak, LAMP, tek bir çipe entegre edilmiş çok amaçlı algılama için uygundur, bu büyük önem taşır, ancak hala geliştirme için çok yer vardır.
LAMP'nin yüksek yanlış pozitif oranı, nispeten düşük reaksiyon sıcaklığı (~37 °C) nispeten daha az buharlaşma problemiyle sonuçlandığından, RPA ile kısmen azaltılabilir [77].RPA sisteminde iki zıt primer, bir rekombinaza bağlanarak DNA sentezini başlatır ve amplifikasyon 10 dakika içinde tamamlanabilir [78,79,80,81].Bu nedenle, tüm RPA süreci, PCR veya LAMP'den çok daha hızlıdır.Son yıllarda, mikroakışkan teknolojisinin RPA'nın hızını ve doğruluğunu daha da geliştirdiği gösterilmiştir [82,83,84].Örneğin, Liu ve ark.[85], ters transkripsiyon RPA (RT-RPA) ve evrensel bir yanal akış test şeridi algılama sistemini entegre ederek SARS-CoV-2'nin hızlı ve hassas tespiti için bir mikroakışkan entegre lateral akış polimeraz rekombinaz amplifikasyon deneyi geliştirdi.tek bir mikroakışkan sisteme dönüştürülür.Şekil 4b).Algılama sınırı 1 kopya/µl veya 30 kopya/numunedir ve algılama yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir.Kong ve ark.giyilebilir bir mikroakışkan cihaz geliştirdiler.[86], RPA kullanarak HIV-1 DNA'sını hızlı ve doğrudan saptamak için vücut ısısını ve cep telefonu tabanlı bir floresan algılama sistemini kullandı (Şekil 4c).Giyilebilir RPA testi, 24 dakika içinde hedef dizinin 100 kopyasını/mL'sini algılayarak, kaynakların sınırlı ortamlarda HIV-1 ile enfekte olmuş bebeklerin hızlı teşhisi için büyük bir potansiyel olduğunu gösterir.
Bakım noktası testinde (POCT) izotermal amplifikasyon.Spin ve reaksiyon SlipChip'in geliştirilmesi ve üretimi.Plazma kaynağından sonra, üst ve alt talaşlar, nihai talaşı oluşturmak için bir takım somunlarla birleştirildi ([76]'dan uyarlanmıştır).b COVID-19 tespiti için MI-IF-RPA sisteminin şeması ([85]'den uyarlanmıştır).c HIV-1 DNA'nın hızlı tespiti için giyilebilir bir RPA testinin şeması ([86]'dan uyarlanmıştır).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, insan immün yetmezlik virüsü HIV, RPA rekombinaz polimeraz amplifikasyonu, LED ışık yayan diyot, MI-IF-RPA Mikroakışkanlar Entegre Yanal Akış Amplifikasyon
Mikroakışkan tabanlı RPA hızla gelişiyor, ancak çip üretimi ve reaksiyon tüketiminin maliyeti çok yüksek ve bu teknolojinin kullanılabilirliğini artırmak için düşürülmesi gerekiyor.Ek olarak, RPA'nın yüksek hassasiyeti, özellikle kontaminasyon varlığında spesifik olmayan ürünlerin amplifikasyonunu etkileyebilir.Bu sınırlamalar, mikroakışkan sistemlerde RPA uygulamasını etkileyebilir ve daha fazla optimizasyonu hak edebilir.POCT'de RPA tabanlı mikroakışkan stratejilerin uygulanabilirliğini geliştirmek için çeşitli hedefler için iyi tasarlanmış primerler ve problara da ihtiyaç vardır.
Cas13 ve Cas12a, nükleik asitleri rastgele parçalama yeteneğine sahiptir ve bu nedenle tespit ve teşhis araçları olarak geliştirilebilir.Cas13 ve Cas12a, sırasıyla hedef DNA veya RNA'ya bağlanma üzerine aktive edilir.Aktive edildiğinde, protein yakındaki diğer nükleik asitleri parçalamaya başlar, bundan sonra patojene özgü nükleik asitleri hedefleyen kılavuz RNA'lar söndürülmüş floresan probları parçalayabilir ve floresan salabilir.Bu teoriye dayanarak, Kellner ve ark.[87] Cas13 tabanlı bir yöntem geliştirdi [Spesifik Yüksek Hassasiyetli Enzimatik Raportör Kilit Açma (SHERLOCK)] ve Broughton ve ark.[88] Cas12a'ya [DNA endonükleazını (DTECR) hedefleyen CRISPR Trans Reporter] dayalı başka bir yaklaşım geliştirdi.
Son yıllarda, CRISPR'ye dayalı nükleik asitlerin tespiti için çeşitli yöntemler ortaya çıkmıştır [89, 90].Konvansiyonel CRISPR tabanlı yöntemler, nükleik asit ekstraksiyonu, amplifikasyon ve CRISPR tespiti dahil olmak üzere çoklu prosedürler nedeniyle genellikle zaman alıcı ve yoğun emek gerektirir.Sıvıların havaya maruz kalması, yanlış pozitif sonuç olasılığını artırabilir.Yukarıda verilenler göz önüne alındığında, CRISPR tabanlı sistemlerin ciddi şekilde optimizasyona ihtiyacı var.
CRISPR-Cas12a ve CRISPR-Cas13a algılama uygulamaları için paralel olarak 24 analiz gerçekleştirebilen pnömatik kontrollü bir mikroakışkan platformu geliştirilmiştir [91].Sistem, nükleik asit amplifikasyonunu atlayan ve femtomolar DNA ve RNA örneklerini otomatik olarak saptayan bir floresan algılama cihazı ile donatılmıştır.Chen et al.[92] santrifüj mikroakışkanlarda CRISPR-Cas12a sistemi ile entegre rekombinaz amplifikasyonu (Şekil 5a).Cas12a, haberci DNA'yı sindirebildiği ve amplifikasyon sürecini engelleyebildiği için bu çalışma, bu iki işlemi entegre etme zorluğunun üstesinden gelir.Ayrıca Chen ve ark.[92] ayrıca tüm süreci otomatik olarak tamamlamak için reaksiyon reaktiflerini bir santrifüj mikroakışkan kontrolünde önceden depoladı.Başka bir çalışmada Silva ve ark.[93], CRISPR/Cas12a amplifikasyonu olmayan bir tanı yöntemi ve SARS-CoV-2'yi tespit etmek için bir akıllı telefon geliştirdi (Şekil 5b).Cep telefonu tabanlı amplifikasyonsuz sistem olarak bilinen bu tahlil, mikroakışkan kanallarda katalaz tarafından oluşturulan kabarcık sinyallerinin akıllı telefon görselleştirmesine dayanan CRISPR/Cas'a bağlı bir enzim içerir.Ön amplifikasyon olmadan 50 kopya/µl'den daha az nükleik asidin hassas tespiti, numune enjeksiyonundan sinyal okumaya kadar tüm süreç sadece 71 dakika sürer.
CRISPR'ye dayalı nükleik asit saptama yöntemleri.CRISPR'ye dayalı entegre moleküler teşhis için Santrifüjlü POCT ([92]'den uyarlanmıştır).b SARS-CoV-2'nin akıllı telefon tabanlı analizi için CASCADE testinin geliştirilmesi ([93]'ten uyarlanmıştır).RAA rekombinaz amplifikasyonu, PAM bitişik protospacer motifi, düzenli aralıklarla CRISPR kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar, CRISPR/CAS'a bağlı enzimlerle cep telefonu amplifikasyonu olmayan CASCADE sistemi, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidroklorür EDC
Nükleik asit tespitinin son adımı olarak sinyal tespiti, teşhis sonuçlarını doğrudan yansıtır ve verimli, hassas ve doğru bir POCT'nin geliştirilmesinde kritik bir faktördür.Sinyaller, floresan, elektrokimyasal, kolorimetrik ve manyetik stratejiler gibi çeşitli yöntemler kullanılarak okunabilir.Bu bölümde, her yaklaşımın gerekçesini açıklıyoruz ve mikroakışkanlarda bulaşıcı hastalıkların moleküler teşhisini karşılaştırıyoruz.
Floresan temelli stratejiler, mükemmel duyarlılık, düşük maliyet, kullanım kolaylığı ve bakım noktası analizi gibi dikkate değer avantajları nedeniyle bulaşıcı hastalıkların POCT teşhisi için yaygın olarak kullanılmaktadır [94, 95].Bu stratejiler, saptanabilir bir sinyal (floresan güçlendirme veya söndürme) oluşturmak için floresan boyalar ve nanomalzemeler gibi etiketli floroforları kullanır.Bu bulgu, floresan tabanlı stratejilerin doğrudan floresan etiketleme, sinyal açık ve sinyal kapalı floresan algılamaya bölünebileceğini düşündürmektedir [96].Doğrudan floresan etiket algılama, bir hedefe seçici olarak bağlandığında belirli bir miktarda floresan oluşturan belirli ligandları etiketlemek için özel floresan etiketler kullanır.Sinyale dayalı floresan tespiti için, floresan sinyalinin kalitesi, ilgilenilen büyüklük ile pozitif olarak ilişkilidir.Floresan yoğunluğu, bir hedefin yokluğunda ihmal edilebilir ve yeterli miktarda hedef mevcut olduğunda saptanabilir.Tersine, "sinyal kapalı" floresansı tarafından tespit edilen floresan yoğunluğu, hedefin miktarı ile ters orantılıdır, başlangıçta maksimum bir değere ulaşır ve hedef büyütüldükçe kademeli olarak azalır.Örneğin, CRISPR-Cas13a hedefe bağlı trans-klevaj mekanizmasını kullanarak, Tian ve ark.[97] ters transkripsiyonu doğrudan atlayan RNA'ları saptamak için yeni bir tanıma stratejisi geliştirdi (Şekil 6a).Tamamlayıcı hedef RNA'lara bağlandıktan sonra, CRISPR-Cas13-RNA kompleksi aktive edilebilir ve spesifik olmayan haberci RNA'lar tarafından transkollateral bölünmeyi tetikler.Floresan olarak etiketlenmiş raportör [florofor (F)], söndürücü (Q) bozulmadan söndürülür ve aktive edilmiş kompleks tarafından bölündüğünde floresan verir.
Elektrokimyasal algılamanın avantajı, yüksek algılama hızı, kolay üretim, düşük maliyet, taşıması kolay ve otomatik kontroldür.POCT uygulamaları için güçlü bir analitik yöntemdir.Grafen alan etkili transistörlere dayanarak Gao ve ark.[98], Borrelia burgdorferi bakterilerinden Lyme hastalığı antijenlerinin 2 pg/mL'lik bir saptama limiti ile multipleks tespiti için bir nanobiyosensör geliştirdi (Şekil 6b).
POCT uygulamalarında, taşınabilirlik, düşük maliyet, hazırlık kolaylığı ve görsel okuma avantajlarından yararlanan kolorimetrik testler kullanılmıştır.Kolorimetrik saptama, hedef nükleik asitlerin varlığı hakkındaki bilgileri görünür renk değişikliklerine dönüştürmek için peroksidaz veya peroksidaz benzeri nanomateryallerin oksidasyonunu, nanomalzemelerin agregasyonunu ve indikatör boyaların eklenmesini kullanabilir [99, 100, 101].Özellikle, altın nanoparçacıkları kolorimetrik stratejilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve hızlı ve önemli renk değişimlerini indükleme yetenekleri nedeniyle, enfeksiyon hastalıklarının yerinde teşhisi için POCT kolorimetrik platformların geliştirilmesine artan bir ilgi vardır [102].Entegre bir santrifüj mikroakışkan cihazı [103] ile kontamine süt numunelerindeki gıda kaynaklı patojenler otomatik olarak 10 bakteri hücresi düzeyinde tespit edilebilir ve sonuçlar 65 dakika içinde görsel olarak okunabilir (Şekil 6c).
Manyetik algılama teknikleri, manyetik malzemeleri kullanarak analitleri doğru bir şekilde saptayabilir ve son yıllarda POCT uygulamalarına büyük ilgi duyulmuştur.Manyetik algılama teknikleri, pahalı optik bileşenlerden ziyade düşük maliyetli manyetik malzemeler gibi bazı benzersiz avantajlara sahiptir.Bununla birlikte, bir manyetik alanın kullanılması, algılama verimliliğini arttırır ve numune hazırlama süresini azaltır [104].Ek olarak, manyetik sondalamanın sonuçları, biyolojik numunelerin önemsiz manyetik arka plan sinyali nedeniyle yüksek özgüllük, duyarlılık ve yüksek sinyal-gürültü oranı gösterir [105].Sharma et al.taşınabilir bir mikroçip platformuna bir manyetik tünel bağlantısı tabanlı biyosensör entegre etti.[106] patojenlerin multipleks tespiti için (Şekil 6d).Biyosensörler, patojenlerden izole edilen subnanomolar nükleik asitleri hassas bir şekilde tespit eder.
Tipik sinyal algılama yöntemi.Cas13a'nın hiperlokalize tespiti kavramı ([97]'den uyarlanmıştır).b Lyme GroES scFv ile kombinasyon halinde grafen nanobiyosensör FET ([98]'den uyarlanmıştır).c Santrifüjlü mikroakışkan çipte gıda kaynaklı patojenlerin multipleks tespiti için kolorimetrik endikasyonlar: Hedef patojenleri olan 1 ve 3 numaralı örnekler ve hedef patojenleri olmayan 2, 4 ve 5 numaralı örnekler ([103]'ten uyarlanmıştır) .d Bir platform, yerleşik bir engelleme amplifikatörü, bir kontrol ünitesi ve sinyal üretimi/alımı için bir güç kaynağı ([106]'dan uyarlanmıştır) içeren bir manyetik tünel bağlantısına dayalı biyosensör.GFET Grafen FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metakrilat
Yukarıdaki saptama yöntemlerinin mükemmel özelliklerine rağmen, yine de dezavantajları vardır.Bu yöntemler, bazı uygulamalarla (artı ve eksileri) ayrıntılı olarak dahil edilerek karşılaştırılmıştır (tablo 1).
Mikroakışkanların, mikroelektromekanik sistemlerin, nanoteknolojinin ve malzeme biliminin gelişmesiyle birlikte, bulaşıcı hastalıkların tespiti için mikroakışkan çiplerin kullanımı sürekli olarak ilerlemektedir [55,96,107,108].Minyatür ekipman ve sıvıların hassas şekilde işlenmesi, teşhis doğruluğuna ve maliyet etkinliğine katkıda bulunur.Bu nedenle, daha fazla geliştirme için, çipleri optimize etmek ve yükseltmek için çaba sarf edildi, bu da farklı yapılara ve işlevlere sahip çeşitli mikroakışkan çiplerle sonuçlandı.Burada kısaca birkaç yaygın mikroakışkan platform türünü tanıtıyoruz ve özelliklerini (artıları ve eksileri) karşılaştırıyoruz.Ayrıca, aşağıda listelenen örneklerin çoğu, öncelikle SARS-CoV-2 ile mücadeleye odaklanmaktadır.
LOCC'ler en yaygın minyatürize edilmiş karmaşık analitik sistemlerdir ve operasyonları oldukça minyatürleştirilmiştir, entegre edilmiştir, otomatikleştirilmiştir ve numune enjeksiyonu ve hazırlama, akış kontrolü ve sıvı algılamadan paralel hale getirilmiştir [109, 110].Sıvılar, dikkatle tasarlanmış geometri ve basınç gradyanları, kılcal hareket, elektrodinamik, manyetik alanlar ve akustik dalgalar gibi birçok fiziksel etkinin etkileşimi yoluyla manipüle edilir [111].LOCC, hızlı analiz hızı, küçük örnek boyutu, düşük güç tüketimi ve yüksek yönetim ve operasyon verimliliği ile yüksek verimli tarama ve çoklu algılamada mükemmel avantajlar gösterir;ancak, LOCC cihazları çok hassastır ve üretim, paketleme ve arabirimdir.Bununla birlikte, çoğullama ve yeniden kullanım çok büyük zorluklarla karşı karşıyadır [96].Diğer platformlarla karşılaştırıldığında, LOCC, maksimum uygulama çeşitliliği ve en iyi teknoloji uyumluluğu açısından benzersiz avantajlara sahiptir, ancak dezavantajları da açıktır, yani yüksek karmaşıklık ve zayıf tekrarlanabilirlik.Genellikle hacimli ve pahalı olan harici pompalara bağımlılık, POCT'de kullanımlarını daha da sınırlandırır.
COVID-19 salgını sırasında LOCC büyük ilgi gördü.Aynı zamanda, birkaç teknolojiyi birleştiren birkaç yeni çip var.Örneğin, akıllı telefonlar artık taşınabilir analiz cihazları olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve LOCC entegrasyonu için büyük potansiyele sahiptir.Güneş et al.[21], SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere beş patojenin spesifik nükleik asit sekanslarının LAMP kullanılarak çoğullanmasına izin veren bir mikroakışkan çip üretti ve reaksiyonun bitiminden sonraki 1 saat içinde bir akıllı telefon kullanarak bunları analiz etti.Başka bir örnek olarak, Sundah ve ark.[112], akıllı telefonlar kullanarak SARS-CoV-2 RNA hedeflerinin doğrudan ve hassas tespiti için bir moleküler anahtar [moleküler geçiş durumu anahtarı (CATCH) ile katalitik amplifikasyon] oluşturdu. CATCH, taşınabilir LOCC ile uyumludur ve üstün performans sağlar (yaklaşık 8 RNA kopyası/µl; oda sıcaklığında < 1 saat) [112]. CATCH, taşınabilir LOCC ile uyumludur ve üstün performans sağlar (yaklaşık 8 RNA kopyası/µl; oda sıcaklığında < 1 saat) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примернотивным LOCC и обеспечивает производительность (примернотивным) CATCH, taşınabilir LOCC ile uyumludur ve mükemmel verim sağlar (yaklaşık 8 RNA kopyası/µl; oda sıcaklığında < 1 saat) [112]. YAKALAMA 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 YAKALAMA 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 кетельностьк;пет112 копитладает превосходной) CATCH, taşınabilir LOCC'ler ile uyumludur ve mükemmel performansa sahiptir (yaklaşık 8 RNA kopyası/µl; oda sıcaklığında < 1 saat) [112].Ek olarak, moleküler teşhis için LOCC cihazları ayrıca vakum, esneme ve elektrik alanları gibi bazı itici güçleri kullanır.Kang ve ark.[113], bir vakum plazmonik sıvı PCR çipi kullanarak sahada COVID-19'un hızlı ve kantitatif teşhisi için çip üzerinde gerçek zamanlı, ultra hızlı nanoplazma üzerinde bir PCR gösterdi.Li ve ark.[114] daha sonra COVID-19 tanısını mümkün kılan streç güdümlü bir mikroakışkan çip geliştirdi.Platform, bir örneğin niteliksel olarak pozitif mi yoksa negatif mi olduğunu belirlemek için RT-LAMP amplifikasyon sistemini kullanır.Daha sonra Ramachandran ve ark.[115], mikroakışkanlarda uygulanan seçici bir iyon odaklama tekniği olan izotakoforez (ITP) kullanarak uygun elektrik alan gradyanlarını elde etti.ITP ile ham nazofaringeal sürüntü örneklerinden hedef RNA otomatik olarak saflaştırılabilir.Daha sonra Ramachandran ve ark.[115] Bu ITP saflaştırmasını ITP ile geliştirilmiş LAMP ve CRISPR tahlilleri ile birleştirmek, insan nazofaringeal sürüntü ve klinik numunelerde yaklaşık 35 dakika içinde SARS-CoV-2'yi tespit etti.Ayrıca sürekli olarak yeni fikirler ortaya çıkıyor.Jadhav et al.[116], dikey olarak yönlendirilmiş altın/gümüş kaplı karbon nanotüpler veya tek kullanımlık elektrospun mikro/nanotüpler içeren bir mikroakışkan cihaz ile kombinasyon halinde yüzeyi güçlendirilmiş Raman spektroskopisine dayalı bir teşhis şeması önerdi.Membran işlevli yerleşik filtre mikro kanalları tek kullanımlıktır.Cihaz, tükürük, nazofarenks ve gözyaşı gibi çeşitli vücut sıvılarından/eksüdasyonlarından virüsleri emer.Bu nedenle, virüs titresi boldur ve virüs, Raman imzasıyla doğru bir şekilde tanımlanabilir.
LOAD, tüm süreçlerin mikro yapılı bir alt tabakayı döndüren bir frekans protokolü ile kontrol edildiği bir merkezkaç mikroakışkan platformudur [110].LOAD cihazı, önemli bir itici güç olarak merkezkaç kuvvetinin kullanılmasıyla karakterize edilir.Sıvılar ayrıca kılcal, Euler ve Coriolis kuvvetlerine de tabidir.Bir santrifüj cihazı kullanılarak, analizler, radyal içe doğru konumdan dışa doğru sürekli sıvı işletiminde gerçekleştirilir ve ek harici boru tesisatı, pompalar, aktüatörler ve aktif valflere olan ihtiyacı ortadan kaldırır.Kısacası, tek bir kontrol yöntemi işlemi basitleştirir.Yük merkezinden aynı uzaklıkta aynı mikroakışkan kanalında sıvıya etkiyen kuvvetler eşittir, bu da kanal yapısının tekrarlanmasını mümkün kılar.Bu nedenle, LOAD ekipmanının tasarımı ve üretimi, geleneksel LOCC ekipmanına göre daha basit ve daha ekonomik iken, reaksiyonlar büyük ölçüde bağımsız ve paraleldir;bununla birlikte, santrifüj ekipmanının yüksek mekanik mukavemeti nedeniyle, mevcut talaş malzemesi sınırlıdır ve küçük hacimler zordur.arabaya.Aynı zamanda, çoğu LOAD cihazı yalnızca tek kullanım için tasarlanmıştır, bu da büyük ölçekli algılama için pahalıdır [96, 117, 118, 119].
Son yıllarda, en umut verici mikroakışkan cihazlardan biri olarak kabul edilen LOAD, araştırmacılardan ve üreticilerden büyük ilgi gördü.Böylece, LOAD geniş bir kabul görmüş ve özellikle COVID-19 salgını sırasında bulaşıcı patojenlerin moleküler teşhisi için kullanılmıştır [120, 121, 122, 123, 124].Örneğin, 2020'nin sonunda Ji ve ark.[60], boğaz sürüntü örneklerinde SARS-CoV-2 ve influenza A ve B enfeksiyonlarının hızlı ve otomatik paralel tespiti için doğrudan bir RT-qPCR testi gösterdi.Daha sonra Xiong ve ark.[74], SARS-CoV-2 dahil olmak üzere yedi insan solunum yolu koronavirüsünün 40 dakika içinde hızlı, doğru ve eşzamanlı tespiti için LAMP ile entegre bir diskoid mikroakışkan platformu sundu.2021'in başlarında de Oliveira ve ark.[73], COVID-19'un RT-LAMP moleküler teşhisi için parmak ucu döndürücü ile manuel olarak çalıştırılan bir polistiren toner santrifüjlü mikroakışkan çip gösterdi.Daha sonra, Dignan ve ark.[39], SARS-CoV-2 RNA'nın doğrudan bukkal sürüntü bölümlerinden saflaştırılması için otomatik bir taşınabilir santrifüj mikro cihazı sundu.Medved et al.[53], 10 kopya/μL algılama limiti ve 15 dakikalık minimum döngü eşiği ile küçük hacimli dönen mikroakışkan floresan çipli bir sıralı SARS-CoV-2 aerosol örnekleme sistemi önerdi.Suarez ve ark.[75] yakın zamanda, LAMP kullanılarak ısıyla inaktive edilmiş nazofaringeal sürüntü örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'nın doğrudan tespiti için entegre bir modüler santrifüj mikroakışkan platformunun geliştirildiğini bildirdi.Bu örnekler, COVID-19'un moleküler teşhisinde LOAD'ın büyük faydalarını ve vaadini göstermektedir.
1945'te Muller ve Clegg [125] ilk olarak filtre kağıdı ve parafin kullanarak kağıt üzerinde mikroakışkan kanalları sundu.2007'de Whitesides grubu [126] protein ve glikoz testi için ilk fonksiyonel kağıt platformunu yarattı.Kağıt, mikroakışkanlar için ideal bir alt tabaka haline geldi.Kağıt, hidrofiliklik ve gözenekli yapı, mükemmel biyouyumluluk, hafiflik, esneklik, katlanabilirlik, düşük maliyet, kullanım kolaylığı ve rahatlık gibi doğal özelliklere sahiptir.Klasik µPAD'ler, kağıt alt tabakalar üzerine inşa edilmiş hidrofilik/hidrofobik yapılardan oluşur.Üç boyutlu yapıya bağlı olarak, μPAD'ler iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) μPAD'lere ayrılabilir.2D µPAD'ler mikroakışkan kanallar oluşturmak için hidrofobik sınırlar oluşturarak üretilirken, 3D µPAD'ler genellikle 2D mikroakışkan kağıt katmanlarından, bazen kağıt katlama, kaydırma teknikleri, açık kanallar ve 3D baskı ile yapılır [96].μPAD üzerindeki sulu veya biyolojik sıvılar, birincil olarak, harici bir güç kaynağı olmadan kılcal kuvvet tarafından kontrol edilir ve reaktiflerin ön depolanmasını, numune işlemeyi ve multipleks algılamayı kolaylaştırır.Ancak, doğru akış kontrolü ve multipleks algılama yetersiz algılama hızı, hassasiyet ve yeniden kullanılabilirlik nedeniyle engellenmektedir [96, 127, 128, 129, 130].
Alışılmadık bir mikroakışkan platformu olarak μPAD, HCV, HIV ve SARS-CoV-2 gibi bulaşıcı hastalıkların moleküler teşhisi için yaygın olarak tanıtılmış ve geliştirilmiştir [131, 132].HCV'nin seçici ve hassas tespiti için Tengam ve ark.[133], pirolidinil peptit bazlı oldukça spesifik bir nükleik asit probu kullanan floresan kağıt bazlı yeni bir biyosensör geliştirdi.Nükleik asitler, amino grupları ve aldehit grupları arasında indirgeyici alkilasyon yoluyla kısmen oksitlenmiş selüloz kağıdı üzerinde kovalent olarak hareketsiz hale getirilir ve algılama, floresansa dayalıdır.Bu sinyaller, bir cep telefonu kamerası ile birlikte taşınabilir bir floresan kamera ile özel olarak yapılmış bir alet tarafından okunabilir.Daha sonra, Lu ve ark.[134], DNA redoks göstergesi olarak metilen mavisi kullanarak DNA hibridizasyonu ile HIV hedef tespiti için nikel/altın nanoparçacıklar/karbon nanotüpler/polivinil alkol organometalik çerçeve kompozitlerine dayalı kağıt bazlı esnek bir elektrot tasarladı.Daha yakın zamanlarda, Chowdury ve ark.[135], COVID-19 analit tespiti için LAMP ve taşınabilir görüntüleme teknolojisi ile birlikte ham hasta tükürüğü kullanılarak bakım noktası µPAD testi için varsayımsal bir platform tasarımı sundu.
Yanal akış testleri, sıvıları kılcal kuvvetlerle yönlendirir ve gözenekli veya mikro yapılı alt tabakaların ıslanabilirliği ve özellikleriyle sıvı hareketini kontrol eder.Yanal akış cihazları, numune, konjugat, inkübatör ve algılama ile emici pedlerden oluşur.LFA'daki nükleik asit molekülleri, bağlanma yerinde önceden depolanan ve kompleksler olarak bağlanan spesifik bağlayıcıları tanır.Sıvı inkübasyon ve tespit plakalarından geçerken, kompleksler test ve kontrol hatlarında bulunan yakalama molekülleri tarafından yakalanır ve sonuçları doğrudan çıplak gözle okunabilen gösterir.Tipik olarak, LFA, geleneksel keşiften daha hızlı olan 2-15 dakika içinde tamamlanabilir.Özel mekanizması sayesinde, LFA çok az işlem gerektirir ve ek ekipman gerektirmez, bu da onu çok kullanıcı dostu yapar.Üretimi ve minyatürleştirilmesi kolaydır ve kağıt bazlı alt tabakaların maliyeti daha düşüktür.Bununla birlikte, yalnızca kalitatif analiz için kullanılır ve kantitatif saptama çok zordur ve çoğullama yeteneği ve çıktısı çok sınırlıdır ve bir seferde yalnızca bir yeterli nükleik asit saptanabilir [96,110,127].
LFA'nın çoğu uygulaması immünoanalizlere odaklanmış olsa da, mikroakışkan çiplerde moleküler teşhis için LFA kullanımı da etkili ve popülerdir [136].Hepatit B virüsü durumunda, HIV ve SARS-CoV-2 LFA Gong ve ark.[137] bir yukarı-dönüştürme nanoparçacık LFA platformu önerdi ve bu minyatürleştirilmiş ve taşınabilir platformun çok yönlülüğünü HBV nükleik asit gibi çoklu hedeflerin hassas ve nicel tespiti yoluyla gösterdi.Ayrıca Fu ve ark.[138], düşük konsantrasyonlarda HIV-1 DNA'sının kantitatif analizi için yüzeyle güçlendirilmiş Raman spektroskopisine dayanan yeni bir LFA gösterdi.SARS-CoV-2'nin hızlı ve hassas tespiti için Liu ve ark.[85], RT-RPA ve evrensel bir yanal akış algılama sistemini tek bir mikroakışkan sistemde birleştirerek mikroakışkan-entegre bir RPA yanal akış analizi geliştirdi.
Çeşitli mikroakışkan platformların uygulanması, platformların yeteneklerinden ve avantajlarından tam olarak yararlanarak belirli çalışmalara bağlı olarak değişir.Uygun fiyatlı valfler, pompalar ve kanallarla LOCC, geliştirme için en geniş alana sahip uygulama çeşitliliği ve birlikte çalışabilirlik için en kapsamlı platformdur.Bu nedenle, LOCC'de en yeni çalışmaların ilk deneme olarak yapılmasını ve koşulların optimize edilmesini umuyor ve tavsiye ediyoruz.Ayrıca sistemde daha verimli ve doğru yöntemlerin keşfedilmesi ve kullanılması beklenmektedir.LOAD, mevcut LOCC cihazlarından gelen sıvıların hassas kontrolünde üstündür ve paralel tepkiler ayrı ve senkronize edilebilirken, harici sürücülere ihtiyaç duymadan merkezkaç kuvveti ile tekli sürücülerde benzersiz avantajlar gösterir.Böylece gelecekte LOAD, daha az manuel işlem ve daha olgun ve otomatik teknolojilerle ana mikroakışkan platform haline gelecektir.µPAD platformu, düşük maliyetli, tek kullanımlık tanılama için LOCC ve kağıt bazlı malzemelerin faydalarını birleştirir.Bu nedenle, gelecekteki geliştirme, uygun ve iyi kurulmuş teknolojilere odaklanmalıdır.Ek olarak, LFA çıplak gözle algılama için çok uygundur ve numune tüketimini azaltmayı ve algılamayı hızlandırmayı vaat eder.Ayrıntılı bir platform karşılaştırması Tablo 2'de gösterilmektedir.
Dijital analizler, numuneyi her biri farklı sayıda hedef molekül içeren birçok mikroreaktöre böler [139, 140].Dijital testler, sürekli bir fazdan ziyade mikron ölçekli bölmelerde aynı anda ve ayrı ayrı binlerce paralel biyokimyasal deney gerçekleştirerek mutlak niceleme yapmak için önemli avantajlar sunar.Geleneksel mikroakışkanlarla karşılaştırıldığında, bölme reaksiyonları numune hacmini azaltabilir, reaksiyon verimliliğini artırabilir ve kanallara, pompalara, valflere ve kompakt tasarımlara ihtiyaç duymadan diğer analitik yöntemlerle kolayca entegre edilebilir [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Hücreler, nükleik asitler ve diğer parçacıklar veya moleküller gibi reaktifler ve numuneler dahil olmak üzere çözeltilerin düzgün ve doğru bir şekilde ayrılmasını sağlamak için dijital tahlillerde aşağıdaki iki yöntem kullanılır: (1) sıvı ara yüz kararsızlığından yararlanan emülsiyonları damlatmak;(2) dizi bölümü, cihazın geometrik kısıtlamaları ile gerçekleştirilir.İlk yöntemde, mikrokanallarda reaktifler ve numuneler içeren damlacıklar, ortak akım, çapraz akış, akış odaklama, aşamalı emülsifikasyon, mikrokanal emülsifikasyonu ve viskoz kesme kuvvetleri yoluyla membranlar ve kanal değişikliği ile emülsifikasyon gibi pasif yöntemlerle oluşturulabilir.lokalizasyon [143, 145, 146, 148, 149] veya elektrik, manyetik, termal ve mekanik kontrol yoluyla ek enerji sağlayan aktif yöntemler [150, 151] kullanarak.İkinci yaklaşımda, mikroakışkan odalarındaki en iyi sıvı hacmi tekdüzeliği, mikropitler ve yüzey dizileri gibi aynı boyuttaki uzamsal yapılar tutularak paylaşılır [152,153,154].Özellikle damlacıklar, dijital mikroakışkanlara (DMF) dayalı elektrot dizilerinde de oluşturulabilen ve manipüle edilebilen ana akış bölümleridir.Dielektriklerin elektro-ıslatılması, en iyi çalışılmış DMF teorilerinden biridir, çünkü dielektriklerin elektro-ıslatılması, sıvının şeklini ve farklı kenarlardan geçen asimetrik elektrik sinyallerini kontrol ederek, bireysel damlaların hassas bir şekilde manipüle edilmesini sağlar [141, 144].DMF'deki damlacıklarla yapılan ana işlemler, çeşitli analiz alanlarında, özellikle moleküler tespitte [157, 158, 159] uygulanabilen ayırma, bölme ve birleştirme [151, 155, 156] içerir.
Dijital nükleik asit tespiti, yüksek verimli sekanslama ve sıvı biyopsiye paralel olarak geleneksel PCR ve kantitatif gerçek zamanlı PCR'yi (qPCR) izleyen üçüncü nesil moleküler tanı teknolojisidir.Son yirmi yılda, dijital nükleik asitler, bulaşıcı patojenlerin moleküler teşhisi alanında hızla gelişmiştir [160, 161, 162].Dijital nükleik asit tespitinin mutlak ölçümü, her bir hedef dizinin her bir bölmeye aynı girme olasılığına sahip olmasını sağlamak için numunelerin ve reaktiflerin ayrı bölmelere paketlenmesiyle başlar.Teorik olarak, her bölüme birden fazla hedef dizi atanabilir veya bağımsız bir mikro reaksiyon sistemi olmayabilir.Yukarıda açıklanan çeşitli algılama mekanizmaları aracılığıyla, belirli bir eşiğin üzerinde sinyaller üreten mikrobiyal hedef dizilere sahip bölmeler, çıplak gözle veya bir makine ile görselleştirilebilir ve pozitif olarak etiketlenirken, eşiğin altında sinyal üreten diğer bölmeler pozitif olarak etiketlenir. .her bölüm için sinyali bir boole yapan negatif olanlar.Böylece, oluşturulan bölme sayısı ve reaksiyon sonrası pozitif sonuç oranı hesaplanarak, rutin kantitatif analizler için gerekli olan standart bir eğriye ihtiyaç duymadan test numunelerinin orijinal kopyaları Poisson dağılım formülü kullanılarak eşleştirilebilir. qPCR olarak.[163] Geleneksel moleküler tanı yöntemleriyle karşılaştırıldığında, dijital nükleik asit tespiti daha yüksek derecede otomasyona, daha yüksek analiz hızına ve hassasiyetine, daha az reaktife, daha az kontaminasyona ve daha basit tasarım ve üretime sahiptir.Bu nedenlerle, amplifikasyon ve sinyal okuma tekniklerini birleştiren moleküler teşhis için dijital tahlillerin, özellikle damla tabanlı yöntemlerin kullanımı, kritik SARS-CoV-2 salgını sırasında iyi çalışılmıştır.Örneğin, Yin ve ark.[164] bir mikroakışkan çipte SARS-CoV-2'deki ORF1ab, N ve RNase P genlerini saptamak için damlacık dijital ve hızlı PCR yöntemlerini birleştirdi.Özellikle sistem, 115 saniye içinde, geleneksel PCR'den daha hızlı olan ve bakım noktası tespitinde etkinliğini gösteren pozitif bir sinyali tanımlayabildi (Şekil 7a).Dong et al.[165], Sow ve ark.[157], Chen ve ark.[166] ve Alteri ve ark.[167] ayrıca etkileyici sonuçlarla mikroakışkan bir sistemde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için damlacık dijital PCR (ddPCR) uyguladı.Tespit oranını daha da iyileştirmek için Shen ve ark.[168], görüntü birleştirme tekniklerini kullanmadan 15 saniye gibi kısa bir sürede ddPCR tabanlı çip görüntülemeyi başardı ve laboratuvardan uygulamaya ddPCR teknolojisi sürecini hızlandırdı.Sadece PCR gibi termal amplifikasyon yöntemleri uygulanmakla kalmaz, aynı zamanda reaksiyon koşullarını basitleştirmek ve hızlı tepki vermek için izotermal amplifikasyon yöntemleri de kullanılır.Lu et al.[71] damlacık analizi için, tek adımda yüksek yoğunluklarda çeşitli boyutlarda damlacıklar üretebilen ve dijital LAMP kullanarak SARS-CoV-2 nükleik asitlerini ölçebilen SlipChip'i geliştirdi (Şekil 7b).Hızla gelişen bir teknoloji olan CRISPR, ilave nükleik asit lekelerine gerek kalmadan uygun kolorimetrik görüntüleme yoluyla dijital nükleik asit tespitinde de önemli bir rol oynayabilir.Ackerman ve ark.nükleik asitlerin multipleks değerlendirmesi için bir kombinatoryal matris reaksiyonu geliştirdi.[158] bir mikro kuyu deneyinde CRISPR-Cas13 bazlı nükleik asit saptama reaktiflerini içeren damlacıklarda SARS-CoV-2 dahil olmak üzere 169 insanla ilişkili virüs tespit etti (Şekil 7c).Ek olarak, izotermal amplifikasyon ve CRISPR teknolojisi, her ikisinin avantajlarını birleştirmek için aynı sistemde kullanılabilir.Park et al.[169] Bir CRISPR/Cas12a dijital tahlili, daha kısa ve daha yüksek sinyal-arka plan algılaması ile tek aşamalı bir RT-RPA'ya dayanan, özütlenen ve ısıyla öldürülen SARS-CoV-2'nin tespiti için ticari bir mikroakışkan çipte geliştirilmiştir. zaman oranı., daha geniş dinamik aralık ve daha iyi hassasiyet (Şekil 7d).Bu örneklerin bazı açıklamaları Tablo 3'te verilmiştir.
Nükleik asit tespiti için tipik dijital platform.a Hızlı dijital PCR iş akışı dört temel adımdan oluşur: numune hazırlama, reaksiyon karışımının dağıtımı, amplifikasyon işlemi ve hedef kantifikasyon ([164]'ten uyarlanmıştır).b Yüksek yoğunlukta damlacık oluşumu için SlipChip damlacıklarının analizini gösteren şema ([71]'den uyarlanmıştır).c CARMEN-Cas iş akışı şeması13 ([158]'den uyarlanmıştır).d Tek bir kapta CRISPR/Cas ile gelişmiş dijital virüs algılamaya genel bakış ([169]'dan uyarlanmıştır).W/O yağda su, polidimetilsiloksan PDMS, PCR polimeraz zincir reaksiyonu, DAQ veri toplama, PID orantılı integral türevi, multipleks nükleik asit değerlendirmesi için CARMEN kombinatoryal matris reaksiyonu, SARS-CoV-2, şiddetli akut solunum sendromu, koronavirüs 2 , RT Arka planda ters transkriptaz rekombinaz polimeraz-RPA, S/B sinyalinin amplifikasyonu